FCM原理研究生

1、 第三部分第三部分细胞分析学技术细胞分析学技术fals sensorlaser细胞的形态学参数细胞的形态学参数生物学特征生物学特征细胞化学成分及含量细胞化学成分及含量细胞的功能细胞的功能定量定量固定式固定式 流动式流动式分析细胞学分析细胞学 年青的交叉学科年青的交叉学科 激光技术激光技术 数字计算机技术数字计算机技术 电子物理技术电子物理技术 电子摄像技术电子摄像技术 光电测量技术光电测量技术 荧光细胞化学技术荧光细胞化学技术 单克隆抗体技术等单克隆抗体技术等fcm historyfcm history1934 moldavanl first try1934 moldavanl first t

2、ry（从固定式细胞分析（从固定式细胞分析- -流动式）流动式）1953 1953 crosland-taylor:laminar flowcrosland-taylor:laminar flow（解决难题）（解决难题）1956 coulter1956 coulter（初次应用（初次应用 ）1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho（开拓）（开拓）1967 vandilla and losalamos group: feulgen,1967 vandilla an

3、d losalamos group: feulgen, dna histogram dna histogram（完善）（完善）1969 hulett:sorter(icp-22)1969 hulett:sorter(icp-22)1973 b-d:first commercial fcm-facs i1973 b-d:first commercial fcm-facs i（发展）（发展）1979 ssmu: fcm developing1979 ssmu: fcm developing（推广）（推广）1980 bjnu: first fcm (facs iii) in china1980 bj

4、nu: first fcm (facs iii) in chinaabout 800 fcms in chinaabout 800 fcms in chinafcm historyfcm history1934 moldavanl first try1934 moldavanl first try（从固定式细胞分析（从固定式细胞分析- -流动式）流动式）1953 1953 crosland-taylor:laminar flowcrosland-taylor:laminar flow（解决难题）（解决难题）1956 coulter1956 coulter（初次应用（初次应用 ）1965 kam

5、entsky: spectrometer principle(ortho1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho（开拓）（开拓）1967 vandilla and losalamos group: feulgen,1967 vandilla and losalamos group: feulgen, dna histogram dna histogram（完善）（完善）1969 hulett:sorter(icp-22)1969 hulett:sorter(icp-22)1973 b-d:first commercial fcm-facs i19

6、73 b-d:first commercial fcm-facs i（发展）（发展）1979 ssmu: fcm developing1979 ssmu: fcm developing（推广）（推广）1980 bjnu: first fcm (facs iii) in china1980 bjnu: first fcm (facs iii) in chinaabout 800 fcms in chinaabout 800 fcms in chinacoultercoulter效应原理效应原理+电极板电极板导电液体导电液体fcm historyfcm history1934moldavanl f

7、irst try1934moldavanl first try（从固定式细胞分析（从固定式细胞分析- -流动式）流动式）1953 1953 crosland-taylor:laminar flowcrosland-taylor:laminar flow（解决难题）（解决难题）1956 coulter1956 coulter（初次应用（初次应用 ）1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho（开拓）（开拓）1967 vandilla and losalamos gr

8、oup: feulgen,1967 vandilla and losalamos group: feulgen, dna histogram dna histogram（完善）（完善）1969 hulett:sorter(icp-22)1969 hulett:sorter(icp-22)1973 b-d:first commercial fcm-facs i1973 b-d:first commercial fcm-facs i（发展）（发展）1979 ssmu: fcm developing1979 ssmu: fcm developing（推广）（推广）1980 bjnu: first f

9、cm (facs iii) in china1980 bjnu: first fcm (facs iii) in chinaabout 800 fcms in chinaabout 800 fcms in chinafcm historyfcm history1934moldavanl first try1934moldavanl first try（从固定式细胞分析（从固定式细胞分析- -流动式）流动式）1953 1953 crosland-taylor:laminar flowcrosland-taylor:laminar flow（解决难题）（解决难题）1956 coulter1956

10、coulter（初次应用（初次应用 ）1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho1965 kamentsky: spectrometer principle(ortho（开拓）（开拓）1967 vandilla and losalamos group: feulgen,1967 vandilla and losalamos group: feulgen, dna histogram dna histogram（完善）（完善）1969 hulett:sorter(icp-22)1969 hulett:sorter(icp-22)1973 b-d:fi

11、rst commercial fcm-facs i1973 b-d:first commercial fcm-facs i（发展）（发展）1979 ssmu: fcm developing1979 ssmu: fcm developing（推广）（推广）1980 bjnu: first fcm (facs iii) in china1980 bjnu: first fcm (facs iii) in chinaabout 800 fcms in chinaabout 800 fcms in china19791979年年 国家科委重点项目：国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流研制国内第一台

12、激光流式细胞仪式细胞仪19821982年年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生19841984年国家科委组织科研成果的鉴定验收年国家科委组织科研成果的鉴定验收19851985年年 获国家卫生部科技成果乙等奖获国家卫生部科技成果乙等奖19851985年年-1990-1990年年 灵敏度、信噪比、更多参数灵敏度、信噪比、更多参数 流式分选仪研制开发流式分选仪研制开发 计算机四参数软件计算机四参数软件 样品制备、医学生物学应用样品制备、医学生物学应用bdbd公司不同型号流式细胞仪公司不同型号流式细胞仪facscaliburlsriifacsariafacscount

13、facsvantage&divafacscantocoulter公司公司不同型号流式细胞仪不同型号流式细胞仪epics xl/xl-mclepics xl/xl-mcl 台式机台式机 cytomicstm fc 500cytomicstm fc 500系列系列 最新型最新型epics altraepics altra细胞分选仪细胞分选仪 大型科研型大型科研型 fcmfcm是以流式细胞仪为检测手段的一项是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术多参数定量分析和分选的技术。fals sensorlaser

14、 流动的流动的 可以是活细胞的可以是活细胞的 定量的定量的 多参数的多参数的 高统计学精度的高统计学精度的 分选细胞分选细胞第一节第一节 流式细胞术的原理流式细胞术的原理 一一 工作原理：工作原理： fcmfcm是一种在计算机技术支持下的高度是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。一一、 fcmfcm仪器的一般仪器的一般结构结构( (一一) )流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统( (二二) )激发光源与光束成形系统激发光源与光束成形系统( (三三) )细胞信号检测与分析处理系统细胞信号检测与分析处理系统 基本工作原理基本工作原

15、理速度速度 轨迹轨迹 层流是液体稳定流动的必要条件层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层管道中层流的形成要满足雷诺数流的形成要满足雷诺数 dv re = 2300， 式中式中、分别为液体的密度和粘滞系数，分别为液体的密度和粘滞系数，d d和和v v分别为管道的直径和液体的平均流速。分别为管道的直径和液体的平均流速。fcmfcm利用层流技术利用层流技术, ,使细胞流动稳定使细胞流动稳定, ,并具有自并具有自聚焦作用聚焦作用, ,为细胞分析分选提供技术保证为细胞分析分选提供技术保证. . ( (一一) )流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统 层流技术层流技术injector tipsheath

16、 fluid流动室流动室 2-3mm方形石英方形石英内径内径200-300 m m 流速慢流速慢,细胞信号大细胞信号大,提高检测灵敏度和精提高检测灵敏度和精度度,小型化。小型化。通过流动室后细通过流动室后细胞一个一个排列胞一个一个排列成单行成单行,依次通过依次通过检测区检测区.把流动室把流动室称为称为单细胞流单细胞流发生器发生器.流动室流动室laser flow cell孔径孔径50-20050-200 m m 检测区离喷口检测区离喷口200200 m m有分选功能有分选功能 液流驱动系统液流驱动系统（示意图）（示意图）流速与压力的关系服从流速与压力的关系服从bernoullibernoull

17、i方程，即方程，即 p=(1/2)p=(1/2) v v2 2 ( (忽略高度的变化忽略高度的变化) )。改变气压。改变气压, ,就可获得不同的流速。就可获得不同的流速。 流体动力自聚焦流体动力自聚焦排气泡排气泡 facsvantage fluid system激光（激光（laser,light amplification by stimulatedemission of radiation)是一是一种相干光源。种相干光源。单谱线，高强度单谱线，高强度. （二）激发（二）激发光源与光束光源与光束成形系统成形系统1-2use0e0e0e1e1e1 吸收吸收自发辐射自发辐射受激辐射受激辐射hvhv

18、hvhvhv 当物质受到强烈激励当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚使某一能级的粒子数大量积聚,发生粒子数反分布发生粒子数反分布.如有光束入射如有光束入射,入射光子与粒子发生入射光子与粒子发生完全弹性碰撞完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子个光子.光子的能量与入射光子能量相同光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向有一致的方向和恒定的位相关系和恒定的位相关系,这种发射称受激发射这种发射称受激发射. 球透镜和柱面透镜球透镜和柱面透镜 ：20200 m 椭圆形光斑，短轴和细胞流平行，长椭圆形光斑，短轴和细胞流平行，长轴与细胞流垂直。轴

19、与细胞流垂直。 光束成形与细胞受照方式光束成形与细胞受照方式 激发光焦斑这种椭圆形光斑的这种椭圆形光斑的检测区保证每个细检测区保证每个细胞分别受到光照胞分别受到光照且受检时受到一致且受检时受到一致的光照的光照 光束成形与细胞受照方式光束成形与细胞受照方式低速低速 高速高速不同样本速率形成的样本流不同样本速率形成的样本流pmtpmtpmtpmtdichroicfiltersbandpassfilterslaser 1234flow cell （三）细胞信号检测与分析处理系统（三）细胞信号检测与分析处理系统光电管光电管细胞散色光的波长是与激发光波长一致的细胞散色光的波长是与激发光波长一致的. .前

20、向散色光信号前向散色光信号: :光电二极管光电二极管侧向及荧光信号用光电倍增管侧向及荧光信号用光电倍增管pmt可将可将散色光及荧光信号转换成电脉冲信号散色光及荧光信号转换成电脉冲信号, ,电脉电脉冲信号通过模数转换器冲信号通过模数转换器(adc)(adc)量化为数字信号量化为数字信号. .longpass shortpass bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系统：光收集系统：滤光片滤光片信号转换系统信号转换系统: :光光 电电 数字信号数字信号( (四四)fcm)fcm细胞分选装置细胞分选装置488 nm laser+-charged p

21、latessingle cells sortedinto test tubesfsc sensorfluorescence detector 超声振荡器超声振荡器:20-40kc液流断离点液流断离点:离喷口离喷口5-8mmf=v/4.5d液滴冲电液滴冲电:幅度荷电多少幅度荷电多少,宽宽度多少液滴带同时带电度多少液滴带同时带电.静电高压偏转板静电高压偏转板:几千伏电压几千伏电压分选细胞的收集装置分选细胞的收集装置: :9696孔板孔板, ,载玻片或试管载玻片或试管通道式分选电荷式分选细胞分选系细胞分选系统统二二、细胞信号的检测与分析细胞信号的检测与分析 制备好的单细胞悬液经仪器检测区时受到制备好

22、的单细胞悬液经仪器检测区时受到激发光的照射激发光的照射. .激光照射在细胞上时可产生激光照射在细胞上时可产生散色光信号和荧光信号散色光信号和荧光信号. .fals sensorlaserforward angle light scatter (fsc)( (一一) )细胞散色光信号细胞散色光信号细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关. .90 degree light scatter (ssc)fals sensor90ls sensorlaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关. .fscssc细胞散色光信号细胞散色光

23、信号( (二二) )细胞荧光测量细胞荧光测量 未经染色的样品细胞未经染色的样品细胞 在激发光的照射下可测到有微弱的荧在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号光信号. . 经过各种特异染色的细胞在经过各种特异染色的细胞在激激 发光的照射下可测到较强的荧光信号发光的照射下可测到较强的荧光信号. .自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图自发荧光信号自发荧光信号特异染色的荧光信号特异染色的荧光信号细胞荧光信号细胞荧光信号ampamp 经过经过pmtpmt将光学信号转变为电脉冲信号，并增加将光学信号转变为电脉冲信号，并增加pmtpmt的电压及的电压及增益，可将脉冲信

24、号进行放大。放大方式有两种：增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大线性放大(lin):(lin):对数放大对数放大(log):(log):荧光信号的测量：荧光信号的测量： 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 线性放大线性放大 对数放大对数放大细胞荧光信号细胞荧光信号荧光光谱重叠荧光光谱重叠 fitcfitc和和pepe荧光光谱重叠荧光光谱重叠uncompensated vs compensatedfl1fl2 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称荧光通道的信号加以扣除

25、的技术称“”荧光补偿荧光补偿荧光补荧光补偿偿三三、fcmfcm测量数据的存贮、测量数据的存贮、 显示和分析显示和分析（一）（一）fcmfcm数据的存贮数据的存贮（二）（二）fcmfcm数据的显示方式数据的显示方式（三）（三）fcmfcm数据的分析数据的分析（一）（一）fcmfcm数据的存贮数据的存贮 list modelist mode方式就是用表格的方式方式就是用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件据全部记录下来，成为一个数据文件。1.1.单参数直方图（单参数直方图（histogramhistogram）2.2.双参数数据

26、显示：双参数数据显示： 二维点图二维点图(dot plot)(dot plot) 等高线图等高线图(contour plot)(contour plot) 二维密度图二维密度图(density plot)(density plot) 假三维图假三维图(pseudo 3d plot)(pseudo 3d plot)3.3.三维图三维图(3d plot)(3d plot)（二）（二）fcmfcm数据的显示方式数据的显示方式. . 单参数直方图的显示单参数直方图的显示 以分布直方图以分布直方图( distribution histogram )( distribution histogram )来显

27、示，横轴为该参数测量强度相对值，单来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数频数。single-parameter histogram displays单参数直方图的显示单参数直方图的显示. .双参数数据的显示双参数数据的显示 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二参数之间的相关关系，其中包含了更这二参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物

28、学信息。多的生物学信息。双参数数据显示最常用双参数数据显示最常用的是二维的散点图的是二维的散点图( dot plot )( dot plot )。在二维。在二维图上，图上，x x轴代表第一个测量参数，轴代表第一个测量参数，y y轴代表轴代表第二个测量参数。每个点代表一个细胞第二个测量参数。每个点代表一个细胞. .two-parameter data displays点图点图(dot plot) 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。不同的等高线上细胞数不同。二维等高图二维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个

29、测量参纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数数,z,z轴为细胞数。轴为细胞数。假三维等高图假三维等高图. .多参数数据的显示多参数数据的显示 在单一图上同时显示多参数是不可能的。在单一图上同时显示多参数是不可能的。实际工作中是实际工作中是用若干个单参数直方图和各种用若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映各种信息不同组合的双参数数据显示来反映各种信息的。的。多参数测量另一重要意义是通过有关参多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行数进行“设门设门”分析分析 ( gating analysis )( gating analysis )可以是单参数设门，也可以是双参数设门可以是单参

30、数设门，也可以是双参数设门。单参数设门调出双参数显示简称单参数设门调出双参数显示简称“一调二一调二”。不难理解也有不难理解也有“一调一一调一”和和“二调一二调一”和和“二调二二调二”等。等。multiple-parameter data displays 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。非细胞数。多参数直方图多参数直方图 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（一般利用所得参数的两两组合并利用设门（gate)技术，来分析参数之间的相互关系。技术，来分析参数之间的相互关系。多参数显示多参数显示pseudo 3d plot3d plot多参数显示多参数显

31、示通过双参数调阅单参数通过双参数调阅单参数通过单参数调阅双通过单参数调阅双参数参数. . 单参数分布直方图的设区分析单参数分布直方图的设区分析. . 细胞细胞dnadna含量分布直方图的数据分析含量分布直方图的数据分析. . 双参数数据的设门分区分析双参数数据的设门分区分析. . 多参数数据的分析多参数数据的分析（三）（三）fcmfcm数据的分析数据的分析. .单参数分布直方图的设区分析单参数分布直方图的设区分析 这是单参数数据分析中最简单的一种这是单参数数据分析中最简单的一种方法。由于方法。由于fcmfcm一次测量的细胞数多，配一次测量的细胞数多，配合设门和调用等手段获得感兴趣的细胞参合设门

32、和调用等手段获得感兴趣的细胞参数分布直方图。这种统计分布直方图一般数分布直方图。这种统计分布直方图一般可直观地反映出众多有用的信息可直观地反映出众多有用的信息。. .单参数分布直方图的设区分析单参数分布直方图的设区分析 通过细胞通过细胞dnadna含量测定，了解细胞增殖含量测定，了解细胞增殖群体中群体中g g0 0/g/g1 1、s s、g g2 2/m/m细胞各占的比例，进细胞各占的比例，进而分析其细胞动力学各参数。这是而分析其细胞动力学各参数。这是fcmfcm的重的重要应用之一。要应用之一。细胞细胞dnadna含量分布直方图的数含量分布直方图的数据分析通常有两种方法，据分析通常有两种方法，

33、 作图分析法和计作图分析法和计算机拟合法算机拟合法( ( curve fittingcurve fitting ) )。. .细胞细胞dnadna含量分布直方图的数据分析含量分布直方图的数据分析细胞细胞dnadna含量分布直方图的数据分析含量分布直方图的数据分析细胞细胞dnadna含量分布直方图的数据分析含量分布直方图的数据分析计算机拟合法适用范大，应用中要注意以计算机拟合法适用范大，应用中要注意以下一些方面：下一些方面：1 1）fcmfcm仪器仪器cvcv值与细胞荧光染色的好坏会值与细胞荧光染色的好坏会 直接影响曲线拟合的结果。直接影响曲线拟合的结果。2 2）在细胞群体中数量较少的细胞亚群，

34、）在细胞群体中数量较少的细胞亚群， 如如g g2 2/m/m细胞群的分析误差一般大于细细胞群的分析误差一般大于细 胞数量多的亚群。胞数量多的亚群。3 3）曲线拟合有时会出现偏离生物学意义的）曲线拟合有时会出现偏离生物学意义的 分析结果。这种情况下，可改变参量或分析结果。这种情况下，可改变参量或 选用其他数学模型重新分析选用其他数学模型重新分析。. .双参数数据的设门分区分析双参数数据的设门分区分析 在双参数的显示图上，细胞结构和细在双参数的显示图上，细胞结构和细胞功能相同的细胞亚群总表现为集中分布胞功能相同的细胞亚群总表现为集中分布的趋势，不同细胞亚群有其各自的分布区的趋势，不同细胞亚群有其各

35、自的分布区域。设门分区可以是方形、矩形、圆形、域。设门分区可以是方形、矩形、圆形、椭园形甚至各种不规则图形，按细胞亚群椭园形甚至各种不规则图形，按细胞亚群实际的分布情况而定。实际的分布情况而定。 点图点图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞双参数数据的设门分区分析双参数数据的设门分区分析 多参数数据分析的关键在于如何正确通过设多参数数据分析的关键在于如何正确通过设门和调用获取有价值的单参数显示和门和调用获取有价值的单参数显示和/ /或双参或双参数显示。由于多参数相关测量包含的信息量数显示。由于多参数相关测量包含的信息量大，故经常会用多个单参数和大，故经常会用多

36、个单参数和/ /或双参数显示或双参数显示来全面反映其中的各种信息。来全面反映其中的各种信息。由于样品细胞由于样品细胞的种类、处理过程、染色方法等的差异，不的种类、处理过程、染色方法等的差异，不可能规定不变的数据处理步骤。细致认真的可能规定不变的数据处理步骤。细致认真的数据处理可获得大量的正确结果。数据处理可获得大量的正确结果。. .多参数数据的分析多参数数据的分析流式细胞术流式细胞术 fcm如何采用层流技术？如何采用层流技术？fcm细胞散色光信号细胞散色光信号fcm的荧光补偿的荧光补偿fcm的数据储存方式的数据储存方式fcm的不同显示方式的不同显示方式 流式细胞术样品制备流式细胞术样品制备 f

37、low cytometry sample preparation流式细胞术操作流程流式细胞术操作流程：培养细胞培养细胞新鲜组织新鲜组织石蜡包埋石蜡包埋单细胞悬液单细胞悬液制备制备荧光抗体标记荧光抗体标记上机检测上机检测表型测定表型测定细胞分选细胞分选继续培养继续培养fishpcr统计学分析统计学分析fcmfcm的细胞样品制备技术三个部分：的细胞样品制备技术三个部分：一、单分散细胞悬液制备一、单分散细胞悬液制备二、选择性分离细胞亚群二、选择性分离细胞亚群三、细胞荧光染色三、细胞荧光染色 流式细胞术对细胞的分析检测流式细胞术对细胞的分析检测 必须必须 基于基于单个细胞单个细胞的基础上，这是的基础上

38、，这是 流式细胞流式细胞术带来的特殊要求术带来的特殊要求。一、单个分散细胞悬液的制备技术一、单个分散细胞悬液的制备技术（一）（一）实体组织实体组织的单细胞悬液的制备的单细胞悬液的制备（二）石蜡包埋组织单细胞悬液的制备（二）石蜡包埋组织单细胞悬液的制备 常用的分散细胞的方法如下常用的分散细胞的方法如下 1 1、酶消化法、酶消化法 2 2、机械法、机械法 3 3、化学试剂处理法、化学试剂处理法（一）实体组织的单细胞悬液的制备（一）实体组织的单细胞悬液的制备（1 1）原理原理（2 2）常用的酶类试剂）常用的酶类试剂（3 3）酶反应的条件酶反应的条件（4 4）酶消化法的一般步骤酶消化法的一般步骤1 1

39、、酶消化法、酶消化法：（）（）原理原理：这种方法是利用：这种方法是利用酶酶的蛋白质大的蛋白质大分子分子不能进入活细胞膜不能进入活细胞膜，但能够，但能够破坏破坏细胞与细胞与细胞之间的细胞之间的胶原纤维胶原纤维，水解细胞间的，水解细胞间的粘多糖粘多糖成分，分解细胞间的细胞成分，分解细胞间的细胞紧密连结装置紧密连结装置的蛋的蛋白性物质，而使细胞能从组织块上游离到悬白性物质，而使细胞能从组织块上游离到悬浮液中，制备成细胞悬液。浮液中，制备成细胞悬液。、酶消化法、酶消化法a.a.蛋白酶类：蛋白酶类：如胃蛋白酶、胰蛋白酶、如胃蛋白酶、胰蛋白酶、链蛋白酶等，其中胰蛋白酶链蛋白酶等，其中胰蛋白酶( tryps

40、in )( trypsin )最常用。最常用。b.b.胶原酶胶原酶( collagenase( collagenase）：胶原酶能降解几种）：胶原酶能降解几种分子类型的胶原。分子类型的胶原。 其它常用的酶还有弹性蛋白酶，透明质酸酶其它常用的酶还有弹性蛋白酶，透明质酸酶和木瓜蛋白酶等。和木瓜蛋白酶等。 不同类型的组织其化学组成不相同使用不同类型的组织其化学组成不相同使用不同种类的酶，见表不同种类的酶，见表1-11-1。（）常用的酶类剂（）常用的酶类剂表表1-1 1-1 酶种类的选择酶种类的选择胰蛋白酶胰蛋白酶 链蛋白酶链蛋白酶 胶元酶胶元酶人结肠肉瘤人结肠肉瘤 人前列腺人前列腺 小鼠骨髓瘤小鼠骨

41、髓瘤大鼠肾脏大鼠肾脏 人瘤腮腺人瘤腮腺 小鼠乳腺肿小鼠乳腺肿瘤瘤人扁桃体人扁桃体 大鼠乳腺大鼠乳腺 小鼠睾丸小鼠睾丸仓鼠前列腺仓鼠前列腺 仓鼠肾脏仓鼠肾脏 大鼠睾丸大鼠睾丸小鼠肝脏小鼠肝脏 仓鼠胰腺仓鼠胰腺 人脾脏人脾脏仓鼠腮腺仓鼠腮腺 人何杰金氏肿瘤人何杰金氏肿瘤大鼠大鼠结肠肉瘤结肠肉瘤 为使组织细胞分散下来，须注意为使组织细胞分散下来，须注意条件条件的选择和影响因素：的选择和影响因素： a.a. 配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的适宜条件与活细胞要求的生理环境，适宜条件与活细胞要求的生理环境，其中其中包括包括渗透压，渗透压，phph值值( (缓冲液缓冲液) )，各

42、种各种离子浓离子浓度，酶激动剂等。度，酶激动剂等。 b.b. 酶溶液的适用浓度：酶溶液的适用浓度：胃蛋白酶胃蛋白酶 0.5% 0.5% 胶原酶胶原酶 0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶 0.25%( 0.25%( 含含1-10g/ml dnase )1-10g/ml dnase )（）酶反应的条件（）酶反应的条件 c. c. 酶消化过程的最佳酶消化过程的最佳温度温度与持续与持续时间时间：37,15-2037,15-20分钟，分钟，不同组织不同酶而异。不同组织不同酶而异。二次消化二次消化反复数次反复数次, ,直至组织块完全消失。直至组织块完全消失。每克组织每克组织10-15ml10-15ml。 （

43、）酶反应的条件（）酶反应的条件d. d. 终止酶消化反应的方法和措施：终止酶消化反应的方法和措施：加加酶抑制剂酶抑制剂（如大豆胰蛋白酶抑制剂等）；（如大豆胰蛋白酶抑制剂等）；降低酶反应温度降低酶反应温度，将细胞悬液管移至冰水浴，将细胞悬液管移至冰水浴中；对于蛋白酶，加入少量血清以减弱酶对中；对于蛋白酶，加入少量血清以减弱酶对细胞的不利影响。通过细胞的不利影响。通过反复离心漂洗反复离心漂洗，移去，移去酶消化液，彻底终止酶消化过程等。酶消化液，彻底终止酶消化过程等。（）酶反应的条件（）酶反应的条件 a. a. 新鲜组织块放入冰冷的培养液（或生理盐水）。新鲜组织块放入冰冷的培养液（或生理盐水）。 b

44、. b. 坏死部分，纤维、脂肪及血管等剔除。坏死部分，纤维、脂肪及血管等剔除。 c. c. 剪为剪为1.0mm1.0mm3 3大小于冰冷的培养液大小于冰冷的培养液( ( 或生理盐水或生理盐水 ) )。 d. d. 漂洗剪碎的组织块，以洗去剪碎的细胞碎片。漂洗剪碎的组织块，以洗去剪碎的细胞碎片。 e. e. 加入酶消化液（一般加入酶消化液（一般g g组织加消化液组织加消化液10-15ml )10-15ml )。 f. f. 消化消化15-2015-20分钟分钟( 37( 37，间断振荡或吹打，间断振荡或吹打) )，消化，消化 时间视不同组织，不同种类的酶而异。时间视不同组织，不同种类的酶而异。

45、g. g. 终止消化，收集、过滤、低速离心除去碎片。终止消化，收集、过滤、低速离心除去碎片。 h. h. 单细胞悬液进行荧光染色，上机检测或保存备用。单细胞悬液进行荧光染色，上机检测或保存备用。（）酶消化法的一般程序和步骤：（）酶消化法的一般程序和步骤： 有剪碎法、网搓法、研磨法等有剪碎法、网搓法、研磨法等 它是利用机械方法，物理方法给予组织它是利用机械方法，物理方法给予组织 较大的压力或用超声振荡使细胞从组织间较大的压力或用超声振荡使细胞从组织间 分散开来。分散开来。. . 机械法：机械法：贴壁粘连贴壁粘连作用作用钙镁离子钙镁离子结合掉，从而使细结合掉，从而使细胞分散。胞分散。常用试剂有常用

46、试剂有edtaedta、egtaegta、tpbtpb等。等。 . . 化学试剂处理法：化学试剂处理法： edtaedta是一种螯合剂。实际运用时采用是一种螯合剂。实际运用时采用螯合剂加酶学法（主要是采用胰蛋白酶）。螯合剂加酶学法（主要是采用胰蛋白酶）。这样的分散细胞方法效果要比单独采用化这样的分散细胞方法效果要比单独采用化学试剂法好。学试剂法好。其他常用的化学试剂还有其他常用的化学试剂还有triton-x-100triton-x-100，四苯硼等。四苯硼等。机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用

47、尼龙网过滤团块等，如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。但会造成所测化学成份的不良影响。fcmfcm所测细胞所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。染色处理不受影响。 小结小结 检测石腊包埋组织，对细胞成份及特性检测石腊包埋组

48、织，对细胞成份及特性进行进行定量定性分析定量定性分析是近年来流式细胞术在临是近年来流式细胞术在临床肿瘤学的应用和基础生物学的应用，因此，床肿瘤学的应用和基础生物学的应用，因此，石腊包埋组织单细胞悬液制备技术的建立使石腊包埋组织单细胞悬液制备技术的建立使大量存档的临床资料重新得到研究与利用，大量存档的临床资料重新得到研究与利用，从而扩大了流式细胞术的应用范围从而扩大了流式细胞术的应用范围。（二）石腊包埋组织单细胞悬液的制备（二）石腊包埋组织单细胞悬液的制备常用的方法有以下几种：常用的方法有以下几种：. .利用细胞之间密度或体积的差异分离利用细胞之间密度或体积的差异分离. .利用细胞的吸咐力特性分

49、离利用细胞的吸咐力特性分离. .利用单克隆抗体分离细胞亚群利用单克隆抗体分离细胞亚群. .利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群. .利用利用fcmfcm分析技术区分细胞亚群分析技术区分细胞亚群. .利用流式细胞分选术分选细胞亚群利用流式细胞分选术分选细胞亚群二、选择性分离细胞亚群二、选择性分离细胞亚群（1 1）自然沉降法）自然沉降法（2 2）密度梯度离心法，电泳法，离心鼓淘汰法。）密度梯度离心法，电泳法，离心鼓淘汰法。 用淋巴细胞分离液根据各细胞亚群的比重不用淋巴细胞分离液根据各细胞亚群的比重不 同可以分离出淋巴细胞、粒细胞等。同可以分离出淋巴细胞、粒细胞等。.

50、 .利用细胞之间密度或体积的差异分离利用细胞之间密度或体积的差异分离（1 1）玻璃和磁铁吸咐法：纯化淋巴胞）玻璃和磁铁吸咐法：纯化淋巴胞（2 2）花环沉降法：）花环沉降法：t t、b b淋巴细胞的化淋巴细胞的化（3 3）吸咐法：纯化单核细胞）吸咐法：纯化单核细胞. .利用细胞的吸咐力特性分离利用细胞的吸咐力特性分离. .利用单克隆抗体分离细胞亚群利用单克隆抗体分离细胞亚群阳性选择阳性选择阴性选择阴性选择macs-magnetic cellmacs-magnetic cellsorting sorting 磁珠磁珠分离分离 氯化铵选择性破坏红细胞氯化铵选择性破坏红细胞. .利用选择性破坏和保留一

51、部分细胞亚群利用选择性破坏和保留一部分细胞亚群用散射光信号用散射光信号区分淋巴、区分淋巴、粒、单核细胞粒、单核细胞. .利用利用fcmfcm分析技术区分细胞亚群分析技术区分细胞亚群干细胞（干细胞（cd34cd34+ +）的分选）的分选. .利用流式细胞分选术分选细胞亚群利用流式细胞分选术分选细胞亚群488 nm laser+-charged platessingle cells sortedinto test tubesfals sensorfluorescence detector分离结果的验证指标有两方面：分离结果的验证指标有两方面：收获率和纯度收获率和纯度 收获率收获率 是指分离后所得的

52、细胞亚群数是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。 纯度纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比所占的百分比。小结小结三、细胞荧光染色技术三、细胞荧光染色技术 流式细胞术流式细胞术快速分析单细胞快速分析单细胞的各种生物学的各种生物学特性和各种生化成份并特性和各种生化成份并定量测定定量测定这些参数是这些参数是通过荧光细胞化学方法实现的通过荧光细胞化学方法实现的。（一）细胞化学的定义和原则（一）细胞化学的定义和原则（二）细胞悬液中荧光细胞化学方法的特点（二）细胞悬液中荧光细胞化学方法的特点（三）荧光细胞化学

53、的评价标准（三）荧光细胞化学的评价标准（四）（四）fcm荧光细胞化学的分类荧光细胞化学的分类（五）细胞（五）细胞dna荧光荧光染色染色（六）细胞（六）细胞rna荧光荧光染色染色（七）细胞蛋白质（七）细胞蛋白质荧光荧光染色染色（八）其它（八）其它荧光荧光染色方法染色方法三、细胞荧光染色技术三、细胞荧光染色技术. . 荧光细胞化学过程的特异性荧光细胞化学过程的特异性 fcmfcm的荧光细胞化学过程要求有足够的的荧光细胞化学过程要求有足够的 特异性，荧光染料与细胞成分是否为特异特异性，荧光染料与细胞成分是否为特异 性结合。严格控制各种反应条件是保证反性结合。严格控制各种反应条件是保证反 应特异性的重

54、要因素。应特异性的重要因素。 （三）荧光细胞化学的评价标准（三）荧光细胞化学的评价标准. . 荧光细胞化学的化学定量关系荧光细胞化学的化学定量关系 在相同的条件下，荧光反应产物（荧光在相同的条件下，荧光反应产物（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系间有严格的化学定量关系。荧光荧光染色染色定量关系定量关系荧光染色的特异性荧光染色的特异性1. 1. 共价结合的反应过程共价结合的反应过程 feulgenfeulgen反应，反应，fitcfitc与蛋白质分子中的与蛋白质分子中的 自由氨基形成的硫碳氨基键等。自由氨基形成的硫碳氨基键等。2

55、. 2. 插入性结合方式的反应过程插入性结合方式的反应过程 ebeb，pipi，7-7-氨基放线菌素氨基放线菌素d( 7-aad )d( 7-aad )等。等。 结合紧密、稳定，染料不会丢失脱落，结合紧密、稳定，染料不会丢失脱落， 简便，特异性较高，被广泛应用简便，特异性较高，被广泛应用。3. 3. 结构亲合方式的反应过程结构亲合方式的反应过程 吖啶橙与核酸单链结合，派若宁吖啶橙与核酸单链结合，派若宁y y与单与单 链核酸结合等。反应过程易受溶液链核酸结合等。反应过程易受溶液phph的的 影响。结合极弱影响。结合极弱, ,易丢失易丢失。（四）（四）fcmfcm荧光细胞化学的分类荧光细胞化学的分

56、类表表1-2 1-2 常用荧光探针的光谱特性常用荧光探针的光谱特性 分类分类 染料染料 激发谱激发谱 发射谱发射谱 fitc 紫紫 蓝蓝 绿绿 tritc tritc 蓝蓝 绿绿 红红 xritc xritc 绿绿 黄黄 红红 texas red texas red 绿绿 黄黄 红红 phycocyanin phycocyanin 绿绿 黄黄 红红 allophycocyanin allophycocyanin 红红 红红细细胞胞表表面面标标记记染染料料 propidium iodide 蓝蓝- -绿绿 红红 acridine orange 蓝蓝 绿绿 ethidium bromide 蓝蓝- -绿绿 红红 hoechst33258/33342 紫外紫外 蓝蓝 dapi 紫外紫外 蓝蓝 dipi 紫外紫外 蓝蓝 mithramycin 紫紫- -蓝蓝 绿绿 chromomycin a3 紫紫- -蓝蓝 绿绿 acriflavine 蓝蓝 绿绿- -黄黄分类分类 染料染料 激发谱激发谱 发射谱发射谱细细胞胞dnadna染染料料 细胞细胞rna acridineacridine orangeorange 蓝蓝 绿绿 染料染料 pyronine ypyronine y 蓝蓝- -绿绿 红红 fitcfitc 紫紫- -蓝蓝 绿绿 tritctrit