非清髓造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注对嵌合状态及GVH

1、非清髓造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注对嵌合状态及GVHD影响的实验研究                作者：陈宝安，张琰，丁家华，毕延智，赵刚，高冲，孙耘玉，孙雪梅，王骏，陈宁娜，程坚【摘要】  本研究目的是探讨经受者皮肤致敏后的异基因供者淋巴细胞输注（DLI）是否能在促进形成完全供者嵌合（CC）的同时减轻移植物抗宿主病（GVHD）。以C57BL/6小鼠（H-2b，B6）为受者，于第0天接受60Co 线全身照射（TBI），总剂量为

2、5.5 Gy，照射当天移植经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后的BALB/c小鼠（H-2d，BA）外周血干细胞（2×107个），移植后第2天腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg，并分别于移植后第28天输注致敏/未致敏的供者淋巴细胞2×106。结果显示，致敏后DLI的受鼠（黑色）无1例出现GVHD，60天时转变为完全供者嵌合，表型明显呈现为供鼠（白色）特征，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在DLI后早期下降，半月后有所升高，但仍低于正常水平；未致敏的DLI受鼠出现不同程度的GVHD，嵌合率稍有上升，仍表现为混合嵌合体（MC），CD4+/CD8+比值在DLI后早期升高，后期降

3、至正常水平。结论：经受者皮肤致敏后的DLI在诱导CC的同时降低GVHD发病率，CD4+/CD8+比值与GVHD发病率间具有良好的相关性。 【关键词】  非清髓性异基因造血干细胞移植Effects of Sensitized Donor Lymphocyte Infusion on the Chimerism and Graft-versus-Host Disease after Nonmyeloablative Allogeneic Stem Cell TransplantationAbstract    To explore whether the c

4、omplete donor chimerism could be achieved and graft-versus-host disease could be alleviated by  donor lymphocyte  infusion    which was sensitized by the skin of the recipient，female C57BL/6 mice (H-2b，B6) as recipients received total body irradiation (TBI) of 5.5 Gy (60Co -

5、ray) on day 0 followed by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). The allo-grafts consisted of 2×107 peripheral hematopoietic stem cells from mobilized male BALB/c  (H-2d) donor mice with the granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Day 2  after allo-HSCT

6、，the recipient mice were given 200 mg/kg cyclophosphamide intraperitoneally. Afterwards these recipient mice were infused 2×106 sensitized or unsensitized-donor lymphocytes at the  28 days after transplantation. The results showed that the mice receiving sensitized-donor lymphocyte infusio

7、n did not suffer from GVHD and the phenotypic character of the recipient mice (black color) converted to that of the donor mice (white color)，and to become full-donor chimerism. It was found that the ratio 0f CD4+/CD8+ T lymphocytes of them decreased at the earlier period and increased after half mo

8、nth，but which were also lower than that of the normal value. While various grades of acute GVHD was observed in that of the control group and the mixed-chimeras were maintained，though it increased a little，and the ratio of CD4+/CD8+ T lymphocytes increased at first，then decreased to the normal level

9、 half month later. It is concluded that  sensitized DLI converted mixed to comlete donor chimerism without GVHD，and the rate of CD4+/CD8+ has close relation to the incidence of GVHD.Key words    nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation；donor lymphocyte

10、infusion；chimerism；graft-versus-host diseaseJ Exp Hematol 2006；14(1):102-106    异基因外周造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶性血液病的重要手段，特别是近年来随着非清髓性SCT的开展，给更多的血液病患者带来了希望。非清髓性移植以较低强度的预处理诱导受者的免疫耐受，使得供者细胞植入并形成混合嵌合体，减少了移植相关并发症和相关死亡。由于混合嵌合体的移植物抗白血病(GVL)作用较弱1，2，且随着嵌合率的逐渐下降，移植后复发率明显增高，故在其基础上进行供者淋巴细胞输注(DLI)，对加强

11、GVL效应，降低疾病复发率，提高无病生存期具有重要临床意义。GVHD作为DLI后的主要并发症，明显限制了DLI的临床应用，探索一种既避免GVHD而又不损害GVL效应的方法成为目前国内外学者关注的热点之一。本研究探讨C57BL/6小鼠经非清髓性异基因外周造血干细胞移植后，输注经受鼠皮肤致敏后的供者淋巴细胞对于嵌合状态及GVHD发病率的影响，同时检测DLI后T细胞亚群的变化，以评价CD4/CD8比值与GVHD之间的相关性。材料和方法动物受鼠为清洁级雌性C57BL/6小鼠(H-2b，B6)，由中国医学科学院实验动物研究所提供，8-10周龄，体重16.7×1.4 g；供鼠为清洁级雄性BALB

12、/c小鼠(H-2d)，由扬州大学畜牧兽医学院提供，均饲养于东南大学医学院SPF级动物房内，饲料及垫料均经辐照消毒，饮用高压消毒无菌水。试剂及器材  环磷酰胺（CTX，200毫克/支，上海华联制药有限公司产品），重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75微克/支，上海三维生物技术有限公司产品），单克隆荧光抗体（FITC anti-mouse CD3、CD4、CD8，25微克/支，杭州联科公司代理的美国Caltag公司产品），全血样本DNA抽提试剂盒（晶美公司代理的美国Gentra公司产品），60Co放疗机（中国核动力研究设计院GWGT80型60Co远距离治疗机，南京市第二人民医院提

13、供帮助），流式细胞仪(美国Beckman-coulter公司产品)。供鼠外周血动员及干细胞悬液的制备BALB/c小鼠于移植前4天起给予250 g/kg G-CSF，皮下注射，每日1次，末次注射2-3小时后在无菌条件下经内龇静脉取血，置入含EDTA的抗凝管中，利用淋巴细胞分离液(Ficoll-hypaque液，比重1.077，20)水平离心30分钟，400×g，提取单个核细胞，然后用0.01 mmol/L的PBS液漂洗2次后重悬细胞并调节细胞浓度至8×107/ml。异基因干细胞移植受鼠移植前6天开始饮用含红霉素（250 mg/L）和庆大霉素（320 mg/L）的无菌水，并持续

14、至移植后2周。移植当日将受鼠置于清洁级包装的塑料盒内接受60Co 射线5.5 Gy全身照射(TBI)，剂量率167.68 cGy/min，照射后4小时内经尾静脉输注供鼠PBMNC 2×107个，移植后第2天予CTX 200 mg/kg腹腔注射。供鼠淋巴细胞制备移植后第1天起取B6小鼠背部皮肤1 cm×1 cm，埋入供鼠皮内，切口局部缝合。每周1次×4周，以致敏供鼠。第28天致敏与未致敏的供鼠分别经内龇静脉采血后以Ficoll分离淋巴细胞（分离方法同干细胞采集），用0.01 mmol/L的PBS液重悬细胞并调节细胞浓度至8×106/ml。操作均在无菌条件下

15、进行。实验分组设计移植后每3天采血计数白细胞、称量体重，同时观察小鼠状态，排除死亡小鼠，待第21天造血恢复，体重稳步回升后将22只受鼠随机分为3组。A组：单纯移植组（n=6）；B组：第28天回输2×106个未致敏供鼠淋巴细胞（n=8）；C组：第28天回输2×106个致敏后供鼠淋巴细胞（n=8）。同时设预处理对照组，观察造血恢复及表型变化。所有受鼠均未给予GVHD防止措施。GVHD主要观察指标移植后每日观察小鼠体重、体形、体位、毛发、腹泻等，记录存活期，存活时间超过60天者为长期存活。每3天称量体重。死亡小鼠取肝脏、脾脏、小肠和爪垫皮肤组织大体形态观察后置于10%福尔马林液中

16、固定保存，集中包埋、切片，HE染色后光学显微镜下观察，判断GVHD情况。异基因嵌合体的测定于移植后第21、60、90天分别经内眦静脉取各组小鼠外周血250 l，EDTA抗凝后，应用Genomic DNA Purification试剂盒提取DNA，保存于-20。PCR扩增：输入雌性B6小鼠体内的雄性BALB/c小鼠造血干细胞带有Y染色体特有的性别决定基因(SRY基因)。SRY引物用DNAStar软件设计，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列为5TGGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG3，下游引物序列为5GATGGCATGTGGGTTCCTGTCC3，扩增产物为296 bp，以BALB/C的DNA扩增产物为参照。PCR反应体系：10×PCR缓冲液5 l，25 mmol/L MgCl2 5 l，dNTPs 1 l，10 molL上游及下游引物各0.5 l，DNA模板2