重庆医科大学学生创新实验项目

1、重庆医科大学学生创新实验项目 申 请 书 项目名称：大鼠Nano-SiO2气管滴注染毒对胰腺影响机制探究申 请 者：徐馨 郭炳君 江昕 赵婷指导教师：彭惠民 单 位：重庆医科大学实验教学管理中心电 话：申请日期 ：2010年 1月 6日重庆医科大学实验教学管理中心研究项目项目名称大鼠Nano-SiO2气管滴注染毒对胰腺影响机制探究所属学科细胞生物学申请金额 4600元起止时间2010年 1月至 2010 年 8月项目性质学生自选研究课题型科研小组成员姓名性别年级电话及电子邮箱徐馨女08280972029郭炳君女0815215012476江昕女0813657670119

2、赵婷女0815215003883指导教师彭惠民phm614研究内容和意义简介(400500字)以SPF级雄性Wistar 大鼠为实验对象，不同浓度纳米二氧化硅（Nano-SiO2）粉尘悬液对其非暴露式气管滴注染毒。检测病理学改变、单细胞凝胶电泳，超氧化物歧化酶 (SOD)含量活性及细胞IGF一ImRNA表达水平表达。探究纳米二氧化硅（Nano-SiO2）对大鼠的胰腺毒性效应及其作用机制。同时选取适当的中药多糖作为保护剂，探究修复性治疗的可能及作用机制。意义：为纳米材料吸入机体后经血液循环致胰腺损伤效应评价提供理论依据，填补现有实验空白，并可结合临床促进中药现代化在纳米

3、防护中的运用。一、立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献)立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献)研究意义目前对纳米二氧化硅致器官损伤的研究对象多集中在对肺，肾脏，肝，生殖器等易受损器官遗传物质损伤上，对胰腺损伤的研究未见报道。另外有文献指出纳米级二氧化硅的致病机理有别于致矽肺病的微米级二氧化硅，但仍有关联。而矽肺病患者有消化不良的症状，于是我们怀疑消化不良可能与胰腺功能减弱有关。纳米二氧化硅由于其颗粒小，更能透过气血屏障通过血液循环影响人体其它器官。故我们想通过这个实验，探究纳米二氧化硅（Nano-SiO2）对大鼠的胰腺毒性效应，作用机制及可能影响的基因靶

4、点（IGFI），并探究修复性治疗的可能及作用机制。由于纳米材料的遗传毒性的证据还不充分，其具体的作用机制尚不明确，因此还需要利用各种动物试验开展系统的纳米遗传毒理学研究和安全性研究，制定职业防护标准和应用标准，并通过诸如分子水平表面修饰，中药防护等方式来降低有毒纳米材料的遗传毒性，使纳米高科技真正地造福人类。国内外研究现状分析1 纳米材料遗传毒性研究现状近年来，纳米材料(粒径 100nm)被广泛应用于生物医药、材料等领域中，然而纳米微粒的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应使其与宏观材料相比具有特殊的理化性质、生物活性和生物动力学过程。纳米粒子表面的原子或分子数与总原子或分子数

5、的比率随着颗粒尺寸的减小呈指数增加。故基于纳米材料的潜在危害性及暴露人群的广泛性。其生物安全问题已受到全世界的广泛关注。在2007年美国癌症研究学会年会上，美国马萨诸塞州大学学者Paeheco指出，大小只有十亿分之一米的纳米颗粒可以对 DNA造成损伤从而诱发癌症。此前的一些研究也发现，越小的纳米颗粒越有可能穿透细胞并产生毒性作用 。马萨诸塞州大学的研究者认为，一方面，纳米颗粒常小，以至于可以穿透细胞膜和屏障；另一方面，进入细胞后的纳米颗粒对细胞器来说又足够大，以至于可以干扰细胞的正常生长周期 。DNA是最易受到氧自由基攻击的生物大分子之一。机体的代谢每时每刻都有氧自由基产生，一旦氧化与抗氧目化

6、平衡失衡，细胞中的DNA将会因氧化应激而受损，最终可能导致疾病的发生。 近年来，各国学者用微核实验、彗星实验、磷酸化组蛋白7H2AX实验，单细胞凝胶电泳(SCGE)试验等方法对多种纳米材料的遗传毒性进行了研究，但报道的研究结果不一。现有纳米材料遗传毒性研究结果表明，并非所有的纳米材料均有遗传毒性，某些纳米金属、金属氧化物、碳纳米材料的遗传毒性较显著。纳米材料遗传毒性的有无及强弱可能与作用时间、剂量、颗粒大小、纳米颗粒的性状、所处物理化学环境等因素有关。另外，染毒方法多为腹膜下注射和气管滴入，对象多集中在对肺，肾脏，肝，生殖器等易受损器官遗传物质损伤上。近来有学者对如何通过表面修饰降低纳米材料的

7、毒性进行了研究。 有研究表明，活性氧簇(ROS)的生成和氧化应激反应是纳米材料引起多种生物毒性效应的主要方式 j。纳米颗粒和氧化反应体系能够造成DNA损伤，并能活化抑癌蛋白P53和其它DNA修复相关蛋白，从而诱发癌变。这与放射性物质诱发癌变的机制相似。从纳米材料本身特性来看，颗粒的尺寸越小，其比表面积就越大，颗粒表面电子受体和供体活动位点就越多。纳米颗粒表面的电子受体和供体活动位点能与分子氧(02)发生作用，形成超氧离子，并通过歧化反应产生过量ROS。ROS是多种细胞发生氧化应激所产生氧的部分还原代谢产物，包括O 、NO等 自由基产物以及 H，o等非 自由基产物。细胞只要产生一种活性氧，就可通

8、过 自由基链反应产生其他活性氧。适量的ROS具有调节生理的功能，但过量的ROS可以使细胞或机体内的氧化压力增 加，并对核苷酸进行攻击引起 DNA断裂。自由基通过连锁反应首先导致生物膜结构和功能的损伤，使膜蛋白流动性下降，脂质过氧化物含量增加，与膜脂交联形成高聚物。当自由基浓度达到一定程度时，自由基对细胞的作用除直接损伤膜结构外，更重要的是造成DNA损伤，使超螺旋结构解旋，DNA降解。可通过分别取组织细胞匀浆后测定超氧化物歧化酶 (SOD)，丙二醛(MDA)、CAT和GSHPx活性及GSH等物质的含量检测自由基。2 Nano-SiO2的研究现状2.1 SiO2致病机理的自由基学说SiO2引起膜磷

9、脂过氧化必须经由自由基的反应过程。自由基在体内有多种来源，线粒体是主要的来源之一，怍为正常的细胞代谢副产物，自由基在线粒件内不断产生。在氧化礴酸化过程中，大约有1一5 的氧会“逃离正常的细胞色素氧化醇的催化过程经过非催化性的逐步的非共价还原过程，最后形成自由基。主要是O7和H：，后者可进入细胞浆并转化为OH一。 另外，国内外大量学者也都证实过Siot粉尘被肺泡巨噬细胞(AM)吞噬后，能刺激AM 产生活性氧基团，启动脂质过氧化，而且还能干扰AM的能量代谢过程。利用还原塑辅酶I(NADH)和还原塑辅酶I (NADPH)作为电子供体，催化细胞内氧，产生活性氧自由基，同时产生超弱发光。即同O反应生成L

10、O，后者可进攻膜蛋白，也可从相邻脂肪酸倜链中夺取氢原子而扩展脂质过氧化链式和支链反应。因此单个启动事件可以使上百个脂肪酸发生脂质过氧化，其扩展链长度取决于膜脂质和蛋白质的比率、脂肪酸构成、氧浓度及腠内是否存在可阻断链式反应的抗氧化物。总之，当自由基启动脂质过氧化之后，产生一系列具有细胞和膜毒性的脂过氧化产物(LPO)，可导致AM溶酶体膜及细胞膜的损伤，直至AM破裂崩解，这在矽尘所致的肺组织纤维化形成的病理机制中起重要作用。 体内不仅有上述的自由基产生体系，还有一套清除自由基机制称抗氧化系统(Anfioxl-dantSy*tem)。抗氧化系统为细胞提供了一种保护作用，使之免澎自由基的攻击或氧化应

11、激 (OxidativeStress)。有人在实验性矽肺研究中发现，在肺组织脂质过氧化物产量、含量增加的同时，血中抗脂质氧化的活性也明显升高 。抗氧化活性升高的程度，能间接反映机体内自由基的生成情况，同时也能反映机体的抗过氧化的能力。矽肺的形成过程中，体内的抗氧化体系由酶性和非酶性成份组成。前者包括超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)，过氧化氢酶(Catse)，各胱甘肽过氧化氢酶(GlutathionePeroxidase，GSHPX)，细胞色素氧化酶(CytochromePeroxidase)；非酶性者包括维生素E(或n一生育酚)，维生素C(抗坏血醴)，胡萝 素，

12、硒，谷胱甘肽(GSH)等。酶性抗氧化机制可将自由基转化为毒性较高的产物或是能够被机体内的其它机制进一步消除的产物，而非酶性成份可直接与自由基结合而消除之。2.2 相关实验研究王静的【5】等实验发现H0 含量在各脏器纳米组均高于对照组而微米组只在肝、肾24h及脑48h高于对照组(P005)；CAT活性与此相反，在各脏器两个时点的纳米组均较微米组降低(P0、O1)，在肝、脑纳米组48h比24h更低。超氧阴离子含量只在纳米组脑中比对照增加明显，SOD活性在肾24h和脑纳米组降低显著，但与微米组无明显差别。而GSH含量只在肝24h纳米组较对照降低；GSHPx酶活性水平在所有纳米组均低于对照组，而且在脑

13、组织中显著低于微米组。MDA含量在肝脏、肾脏、脑组织中纳米组比对照组高，而微米虽在肝和脑中较对照组高(P005)，但其幅度均较纳米小。总抗氧化能力纳米组各脏器两个时点均比对照组降低(P0，05)，而微米组只在肾脏24h和脑中较对照组降低(P005)脑48h纳米组比微米组下降显著；而肾48h纳米组较24h升高。结论 纳米SiO 致氧化损伤作用较微米 sj 明显，通过不同时点的比较发现48h时Sio，引起的氧化损伤弱于24h时的变化。陈杰等【6】采用气管内非暴露法，分别用纳米SiO 粒径(10土5)nm和常规 SiO。粉尘 粒径 0510 m对雌性 Wistar大 鼠肺脏染尘 (20mg鼠)。染尘

14、后 1个月和2个月时，纳米SiO 组大鼠肺纤维化程度(I期)明显轻于常规SiO。组(I 期)。图像定量分析显示，染尘后 1个月，纳米SiO2组大鼠肺脏IL一4和TGF一01阳性细胞积分光密度值(1、O4士043)10，(O84士017)10明显低于常规SiO 组(333士127)10，(367士063)10，差异有显著性(PO01)。染尘后2个月， 纳米SiO2组大鼠肺脏 IL一4和TGF-13阳性细胞积分光密度值(128士019)10，(086土018)10较染尘后 1个月有所升高，但仍低于常规SiO2组(199士080)10，(490士111)10，差异有显著性 (P001)。结论 纳米S

15、iO 组大鼠肺脏 IL一4和 TGF一0的表达水平较常规SiO 组低，纳米 SiO 致肺纤 维化程度较常规 SiO 粉尘轻。赵颜忠等【8】采用化学合成法制备用于基因治疗的易修饰的氨基化硅纳米颗粒和荧光氨基化硅纳米颗粒。用透射电镜和Zeta电位仪对纳米颗粒进行分析，并参照ISO7406技术报告中的相关标准，对纳米颗粒的生物相容性进行一系列体内及体外实验，包括细胞毒性实验、动物急性毒性实验、动物生殖毒性实验。结果表明：新研制的氨基化硅纳米颗粒的粒径为40nnl左右；在中性条件下，氨基化硅纳米颗粒的表面净正电荷约为16mV；纳米颗粒对细胞生长无明显影响，对实验动物无生长和生殖毒性，与对照组相比无显著

16、性差异。 张英鸽等【9】纳米二氧化硅(NanoSiC2)对大鼠 非暴露式气管滴注染毒。结果显示，纳米材料造成大鼠肺问质性炎症，肺泡结构受到破坏并发生纤维组织增生,形成小结节；与对照组比较，组肺泡灌洗液中总抗氧化力(TAOC)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力降低，白介素一6(IL一6)浓度升高(P005)；在高剂量水平上(10mgm1)，3种纳米材料组支气管肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、丙二醛(MDA)浓度升高(P005)；10IngmlNanoSiC组和 10rfigmlSWCNTs组肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子 (TNFd)水平升高(P005) 3种纳米材料均能对大鼠肺组织造成毒性损伤

17、可引起炎症反应和氧化损伤. 林本成等【10】选择不同剂量的纳米SiO：(2040nm)与微米SiO：(110p,m)，采用气管滴注方式对雄性Wistar大鼠分组染毒于染毒5周后处死大鼠，应用流式细胞技术对睾丸生精细胞进行分析结果表明：1)高、低剂量纳米SiO：组及高剂量微米SiO：组细胞凋亡率均显著高于对照组；2)与对照组相比，高、低剂量纳米SiO：组及高剂量微米SiO：组1c细胞显著减少，4c细胞显著增加；3)与对照组相比，高剂量纳米SiO：组和高剂量微米si02组G0G。期细胞比例显著降低，高剂量纳米SiO：组G2M期细胞比例显著增加结果提示纳米SiO：能够阻滞细胞周期进程，诱导生精细胞凋

18、亡；与微米si02相比，纳米SiO：对大鼠睾丸生精细胞的损伤有更严重的趋势另外林本成等【11】将30只雄性Wistar大鼠分为5组，经气管分别注入不同浓度的纳米Si()(2040nln)与微米Si() (110tan)。雄鼠染毒5周后与正常成年雌鼠按 1：2合笼交配5d，于妊娠第20天各组处死一半雌鼠，检查胎鼠情况；另一半雌鼠自然分娩，检查仔鼠情况。结果纳米SiO2对雄性大鼠染毒影响了大鼠交配及胚胎形成，纳米高剂量组雄鼠交配率(667)及每窝活胎数(118)均小于对照组(100、140)，差异有显著性(P005)。相同剂量纳米组与微米组比较，差异均无显著性(P005)。结论纳米Si0，对雄性大

19、鼠生殖有一定的损伤作用，但对于成功受孕后的胎鼠及仔鼠影响不明显。董辰方等【12】通过原位杂交、斑点杂交及定量分析技术分别检测银系纳米材料组、稀土纳米材料组与对照组WI-38及Hela细胞 IGF-I mRNA表达。结果银系纳米材料组、稀土纳米材料组与对照组的细胞均有 IGF-ImRNA杂交阳性信号表达。膜上斑点杂交经吸光度扫描表明，WI-38细胞及 Hela细胞银系纳米材料组吸光度值与对照组相比差异均无显著性(F一124312，t。一1218，P005)；而稀土纳米材料组吸光度值较对照组均显著性降低(t。一32 46，PO01)。 陈蕾【14】通过基因芯片法检测出染矽尘大鼠14d肺组织中IGF

20、BP3基因表达下调。胰岛素样生长因子I(IGFI)是一种多功能活性肽，具有促进细胞有丝分裂、促进生长发育、促 进物质代谢等作用，哺育动物几乎所有组织和细胞均能合成 IGFI。3 中药多糖的抗氧化性及治疗机制关于多糖的直接抗氧化机制尚无定论，一种解释是，OH可以夺取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而多糖的碳原子上留下单电子可继续氧化形成过氧自由基，后者进一步分解。另一种解释是多糖环上的基团可与OH等所必需的金属离子结合，从而抑制活性氧自由基的产生。 大量实验研究结果表明，多糖类物质是一种天然的非特异性的免疫增强剂，它可以增强机体免疫力，这是中药多糖抗辐射的另一个重要作用机制。它主要作用于网状内皮系

21、统、巨噬细胞、淋巴细胞粒细胞参与调节蛋白质的合成、抗体的生成、补体的生成以及对各种细胞因子表达功能等。有些多糖能增强巨噬细胞的活性。对造血细胞的促进增殖作用。 参考文献 1 郭媛媛 纳米材料的遗传毒性研究进展 国外医学卫生学分册 2008.35.5：2682 ZHAO，CHAIZ EStatusofstudy ofbioenvironmentalactivitiesofnanoscalemartialsJBull ChinAcadSci，2005，20(3)：194199 3 AACRNanoparticlescandamageDNA，increasecancer riskEB20070417

22、http：Ilwwwphysorgcornnews9640 1735htm14 张郁 矽肺脂质过氧化中的氧化与抗氧化系统的研究进展 辐射防护通讯 l997。2。l7。 1：265 靳翠红 金一和 王静等 纳米和微米SiO 吸人染毒对大鼠氧化损伤指标的比较研究 卫 生 研 究 2008.1 37.1:166 董静，陈莹，陈杰等 纳米SiO 和常规SiO 对大鼠肺脏 IL一4和TGF1表达影响的比较研究 工 业 卫 生 与 职 业 病 2005.31.4 : 2O6 7 武树海 陈安启 矽肺发病机理与治疗研究进展 中国疗养医学2001:38 赵颜忠 黄艳艳 陈玉祥 用于基因治疗的硅纳

23、米颗粒的制备及生物安全性评价 中国有色金属学报 200:8809马力 ，袭著革 ，张英鸽等 三种典型纳米材料非暴露式气管滴注染毒对大鼠肺的毒性效应环境与健康杂志 2008.1O.25.10: 847 10林本成 ，袭著革 ，张英鸽等 应用流式细胞分析技术研究微纳尺度SiO2对雄性大鼠睾丸生精细胞的毒性作用 生态毒理学报200:32411林本成，袭著革 ，张英鸽等 微纳尺度SiO2对雄性大鼠生殖功能及子代的影响 解放军预防医学杂志 2008.6.26. 3:17212袭著革 ，杨旭 ，吴曲等 纳米二氧化钛对小鼠肝、肾细胞DNA的损伤 生 态 毒 理 学 报 2008

24、. 3。6： 590-59513董辰方，强 新，丁守怡 等 纳米材料对细胞IGF一工mRNA表达水平的影响青 岛 大 学 医 学 院 学 报200:215 14陈蕾，染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱及手掌参醇提取物对其影响的研究 重庆医科大学硕士学位论文 2008.5.1：5315 FukuharaT，HooperWC，BaylinSB，eta1Useofthepoly merasechainreactiontodetecthypermethylationinthecalcitonAnewsensitiveapproachtomonitortumourcellsi cute

25、myelogenousleukemiaJLeukRes，1992，16：1031二、研究方案1.研究目标、研究内容、研究方法：设置预实验，检验所选择的中药有效成分及剂量是否适合染毒方法与剂量将小鼠随机分为6组，每组7只大鼠，分别为生理盐水组,中药有效成分组，纳米低剂量组（2mgm1），纳米高剂量组（10 mgm1）,纳米低剂量（2mg/ml）混合中药的有效成分组，纳米高剂量(10mg/ml)混合中药的有效成分组。中药制剂每日灌胃。经乙醚麻醉后，采用非暴露式气管内注入法，按1mlkg进行染毒，每次染毒前称重。每日染毒 1次，共染毒3周。染毒期间，动物自由进食和饮水，最后一次染毒后动物禁食不禁水。

26、4周后，大鼠麻醉处死。样品制备及各项指标的测定（1）病理学改变取大鼠胰腺，观察大体形态变化。同时取胰腺组织4甲醛溶液中固定并制成石蜡切片，用于HE染色，光镜观察。（2）细胞悬液制备 处死后迅速取出胰腺，PBS洗去表面的血迹，用眼科剪将组织剪成糜状(约 lmm 的组织块)，再用2层润湿的擦镜纸过滤将细胞滤液分别装人相应的离心管中，1500rmin 离心5min，用PBS重新悬浮细胞并调整细胞密度苔盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率须接近95，调整细胞密度为1o51o6个 mL（3）单细胞凝胶电泳实验 在完全磨毛的载玻片 (75mmx25mm)上铺第一层质量分数为10的正常熔点琼脂糖 180L；待

27、其凝固后，铺第二层质量分数为1。0的低熔点琼脂糖和细胞悬液的混合液(体积比为3：1)1001xL；第二层凝胶固化后，铺第三层质量分数为08的低熔点琼脂 糖 100zL固化条件均为4下放置 10min将制备好的凝胶放入冷的细胞裂解液 (25molL NaC1，100mmolL Na2EDTA，10mmolL riffsbase，1十二烷基肌氨酸钠 ，1 TritonX一100，10DMSO，pH=10)中，4下裂解2h然后放入蒸馏水中漂洗3min，以洗去凝胶表面的盐分， 再放入电泳槽中将新鲜配制的电泳缓冲液 (1molLNaEDTA，300mmolLNaOH，pH=13) 倒入电泳槽，约覆盖过载

28、玻片025cm，盖上盖子，静置20min使双链DNA解螺旋调节电泳液液面高度，于20V、180mA下电泳20min电泳完毕，取出载玻片浸入04molL Iris缓冲液 (pH=75)中，中和2次，每次 15min用吖啶橙(20mgL )染色3min，双蒸水洗掉表面的染料，24h内在荧光显微镜下观察。（4）超氧化物歧化酶 (SOD)活性测定处死大鼠，分离血清保存：取胰腺称重，计算脏器系数。称重后剪碎，与生理盐水按1g：9ml在低温下制成匀浆，4c下3500g离心10min，取组织匀浆上清液备用。采用试剂盒检测超氧化物歧化酶 (SOD)活性。（5）原位杂交测细胞IGF一I mRNA表达水平用 eD

29、NA探针测定 IGFI mRNA的表达。参照文献【15】设计特异性寡核苷酸探针，其序列为：5-GAAGAGATGCGAGGAGGACATGGTGTGCATCTTCA一3。按 DIGDNALabelingandDetectionKit (No1093657)说明进行涂片、杂交及显色。经过以上的检测，观察只加纳米二氧化硅组，中药添加组，空白对照组胰腺损伤情况的比较，并分别比较纳米二氧化硅组之间，中药添加组之间胰腺损伤情况的比较。2.拟解决的关键问题：（1）用 eDNA探针测定 IGFI mRNA的表达（2）单细胞凝胶电泳实验（3）合适的中药有效成分的选择及剂量问题3.研究技术线路： 预试验后分组，

30、染毒病理学检测(测损伤程度)组织匀浆制备细胞悬液制备超氧化物歧化酶 (SOD)活性检测（测自由基）丙二醛(MDA)含量检测（经查试剂盒太贵取消）单细胞凝胶电泳实验（测DNA损伤）原位杂交检测细胞IGF一I mRNA表达4.可行性分析： 1 理论可行实验具有创新性，纳米材料研究尚未成熟而又有一些初步的数据基础。纳米SiO2气管染毒在大鼠其它器官已通过微核实验、彗星实验检测出其它器官的细胞DNA损伤，现有实验表明，纳米SiO2高剂量组，在睾丸，肝，肺，肾超氧化物歧化酶 (SOD)活性阳性。细胞外培养表明染毒后，细胞IGF一I mRNA表达受抑制。故我们推测纳米二氧化硅对胰腺也有损伤，并运用前人采用

31、的实验分析方法与指标对胰腺的损伤进行检测，而某些中药多糖具有去自由基的作用，故我们推测中药多糖对纳米二氧化硅的损伤具有抑制作用。2 实际可行本实验预算不算太多，学校创新基地可提供足够的资金支持和仪器设备支持。指导老师彭老师的研究方向是多基因与糖尿病与本实验有较大关联，可得到彭老师理论和实践上的支持。本小组成员思维活跃，学习实践能力较强，有良好的人际交往能力，团队协作能力强，能有效保证实验的顺利进行。实验设计的几个指标呈模块化，如遇资金限制，可适当舍弃部分指标的检测，对实验结果影响不大。5.技术关键：（1）组织匀浆的制备（2）原位杂交测细胞IGF一I mRNA的表达（3）单细胞凝胶电泳（4）细胞悬液的制备（5）酶活性检测（6）合适的中药有效成分的选择及剂量问题6.研究工作进度安排：第1周，准备阶段：相关理论设计的完善，实验药品试剂及用品，动物的采购，实验室及相关关系的预约。第2周，预实验阶段：学习大鼠的饲喂，气管滴注染毒操作练习，纳米SiO2悬液的配制及分光光度法进行浓度检测，学习组织切片制作技术，组织匀浆的制备技术，细胞悬液制备技术和单细胞凝胶电泳技术等技术。第3至5周，实验一阶段：染毒。同时设计探