槐米中芦丁的提取分离与鉴定(1)

1、天然药物化学实训天然药物化学实训项目一项目一槐米中芦丁的提取分离槐米中芦丁的提取分离与鉴定与鉴定实训目的实训目的v能够运用碱溶酸沉法和结晶法的操作技术对能够运用碱溶酸沉法和结晶法的操作技术对槐米中的芦丁进行提取分离槐米中的芦丁进行提取分离v能够运用酸水解的操作技术对槐米中芦丁进能够运用酸水解的操作技术对槐米中芦丁进行水解行水解v能够运用纸色谱、薄层色谱法和化学法鉴别能够运用纸色谱、薄层色谱法和化学法鉴别芦丁、槲皮素和糖类化合物芦丁、槲皮素和糖类化合物得到两个单体化合物得到两个单体化合物OHOOHOOHOHOH57334实训结果实训结果芦丁芦丁槲皮素槲皮素OHOOHOOOHOHOOHOHOHCH

2、2OOOHOHOH项目一项目一 芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定v子项目一子项目一 槐米中芦丁的提取槐米中芦丁的提取v子项目二子项目二 槐米中芦丁的精制槐米中芦丁的精制v子项目三子项目三 水解芦丁得到槲皮素水解芦丁得到槲皮素v子项目四子项目四 芦丁和槲皮素的鉴别芦丁和槲皮素的鉴别相关内容介绍相关内容介绍芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定槐花槐花槐米槐米槐花为豆科植物槐槐花为豆科植物槐Sophora japonicaSophora japonica L L的干的干燥花及花蕾燥花及花蕾相关内容介绍相关内容介绍芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定v性能：苦，性微寒。性能：苦，性微寒

3、。 v功效：凉血止血、清肝泻火功效：凉血止血、清肝泻火 v应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。 主要含有主要含有芦丁、槲皮素芦丁、槲皮素，还含少量皂苷类及，还含少量皂苷类及多多糖、粘液质糖、粘液质等。近代研究表明槐米含芦丁可高等。近代研究表明槐米含芦丁可高达达23.5%，槐花开放后降至，槐花开放后降至13.0%。相关内容介绍相关内容介绍芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定芦丁芦丁OHOOHOOOHOHOOHOHOHCH2OOOHOHOH性状：性状：浅黄色粉末或极细微淡黄色针浅黄色粉末或极细微

4、淡黄色针状结晶。状结晶。 溶解度：溶解度：在冷水中在冷水中1:100001:10000，沸水中，沸水中1:2001:200；冷乙醇中；冷乙醇中1:2001:200，沸乙醇中，沸乙醇中1:601:60。沸甲醇中。沸甲醇中1:71:7。 酸碱性：酸碱性：芦丁分子中具有较多酚羟基，芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出。可析出。相关内容介绍相关内容介绍芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定芦丁芦丁OHOOHOOOHOHOOHOHOHCH2OOOHOHOH用于治疗毛细管脆弱引用于治疗毛细管脆弱引起的出血病，并用作高起的出血病，并用作高血压的辅

5、助治疗剂。血压的辅助治疗剂。相关内容介绍相关内容介绍芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定槲皮素槲皮素性状：性状：黄色针状结晶（稀乙醇）。黄色针状结晶（稀乙醇）。 溶解度：溶解度：冷乙醇中冷乙醇中1:3001:300，热乙醇中，热乙醇中1:231:23。可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰乙酸、吡啶，不溶于水、氯仿、乙冰乙酸、吡啶，不溶于水、氯仿、乙醚、苯和石油醚等。醚、苯和石油醚等。 OHOOHOOHOHOH57334思考问题思考问题1 1、加入硼砂目的是什么？、加入硼砂目的是什么？2 2、为什么要加入石灰水，在芦丁的提取中能、为什么要加入石灰水，在芦丁的提取中能起到

6、什么作用？起到什么作用？3 3、酸沉、酸沉pHpH值为什么不宜过低？值为什么不宜过低？子项目一子项目一 槐米中芦丁的提取槐米中芦丁的提取v那个天然产物的实验，要算下得率那个天然产物的实验，要算下得率,粗芦丁重粗芦丁重量量/槐米的重量；槐米的重量； 精制芦丁的重量精制芦丁的重量/粗芦丁的粗芦丁的重量；并且计算下，每克芦丁分子中槲皮素重量；并且计算下，每克芦丁分子中槲皮素和糖所占的百分比。和糖所占的百分比。所需的试剂和设备v1、样品：槐花米槐花米v试剂：硼砂、硼砂、CaOCaO、浓盐酸、浓盐酸v仪器：每一组需要：仪器：每一组需要： 电炉、电炉、1000ml1000ml烧杯、烧杯、小烧杯、小烧杯、

7、500ml500ml烧杯、玻璃棒、烧杯、玻璃棒、pHpH试纸、玻试纸、玻璃漏斗、滴管璃漏斗、滴管 v公共需要：棉花、天平公共需要：棉花、天平子项目一子项目一 槐米中芦丁的提取槐米中芦丁的提取搅拌下加搅拌下加入石灰乳入石灰乳加加0.4%0.4%硼砂沸硼砂沸水水200ml200ml槐花米槐花米（2525g g）调节调节pH8-9pH8-9加热加热保持微保持微沸沸20min20min趁热用棉花趁热用棉花滤过滤过滤液滤液残渣残渣在在60-7060-70度下，用度下，用浓盐酸调浓盐酸调pH3-4pH3-4静置静置提提取取芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定补充水分，补充水分，保证保证pHpH值值v2

8、010.11月，实验结果：食品091班30克槐米制得的粗芦丁大约58克不等。思考问题思考问题先进行项目二，冷却后等沉沉析出时候，再讨论项目先进行项目二，冷却后等沉沉析出时候，再讨论项目3 31 1、以热水重结晶法精制芦丁的依据是什么？、以热水重结晶法精制芦丁的依据是什么？2 2、重结晶的操作要点有哪些？、重结晶的操作要点有哪些？子项目二子项目二 槐米中芦丁的精制和水解槐米中芦丁的精制和水解需要的仪器设备需要的仪器设备v每组需要抽滤设备（需要每组需要抽滤设备（需要1000ml的抽滤瓶）、的抽滤瓶）、滤纸、滤纸、 玻璃棒、玻璃棒、1000ml烧杯、加热回流设烧杯、加热回流设备（电热套、冷凝管、烧瓶

9、）、小烧杯、浓备（电热套、冷凝管、烧瓶）、小烧杯、浓硫酸、浓盐酸硫酸、浓盐酸第一次实验所得滤液第一次实验所得滤液滤液滤液沉淀（粗品芦丁）沉淀（粗品芦丁）重结晶重结晶抽滤，抽滤，少量水洗涤沉淀至中性少量水洗涤沉淀至中性取粗制芦丁取粗制芦丁3g,3g,加蒸馏水加蒸馏水400ml,400ml,煮沸煮沸1010分钟后，趁分钟后，趁热抽滤热抽滤残渣残渣滤液滤液冷却（可以用流动水快速冷却）静置冷却（可以用流动水快速冷却）静置精制芦丁（备用）精制芦丁（备用）芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定提提取取与与精精制制抽滤，抽滤， 干燥、称重干燥、称重v食品食品091班得到的精制芦丁大约（粗芦丁班得到的精制芦

10、丁大约（粗芦丁4克克精制后大约？）精制后大约？）减压抽滤装置减压抽滤装置v减压过滤操作减压过滤操作v v装置装置:布式漏斗布式漏斗,抽滤瓶抽滤瓶,胶管胶管,抽气泵抽气泵,滤纸滤纸 v过程过程: v1、安装仪器、安装仪器,检查布式漏斗与抽滤瓶之间连接是否检查布式漏斗与抽滤瓶之间连接是否紧密，抽气泵连接口紧密，抽气泵连接口是否漏气是否漏气； v2、修剪滤纸，使其略小于布式漏斗，但、修剪滤纸，使其略小于布式漏斗，但要把所有要把所有的孔都覆盖住，并滴加蒸馏水使滤纸与漏斗连接紧密；的孔都覆盖住，并滴加蒸馏水使滤纸与漏斗连接紧密； v3、将固液混合物转移到滤纸上；、将固液混合物转移到滤纸上； v4、打开抽

11、气泵开关，开始抽滤。、打开抽气泵开关，开始抽滤。 v5、过滤完之后，、过滤完之后，先抽掉抽滤瓶接管，后关抽气泵。先抽掉抽滤瓶接管，后关抽气泵。（防止倒吸）（防止倒吸） 思考问题思考问题1 1、芦丁是？苷（、芦丁是？苷（ N- N- 苷苷 、O-O-苷、苷、S-S-苷苷or C-or C-苷苷? ?2 2、苷键的裂解可以用什么方法、苷键的裂解可以用什么方法 ？最常用的方？最常用的方法是？法是？ 影响酸水解速度的因素有哪些？影响酸水解速度的因素有哪些？2 2、芦丁水解后的产物是什么？、芦丁水解后的产物是什么？3 3、如何进行苷类酸水解操作，如何分离得到、如何进行苷类酸水解操作，如何分离得到苷元成分

12、？苷元成分？子项目三子项目三 水解芦丁得到槲皮素水解芦丁得到槲皮素子项目三子项目三 水解芦丁得到槲皮素水解芦丁得到槲皮素芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定精制芦丁精制芦丁1.5g1.5g加入加入2%2%硫酸或者硫酸或者(1mol/lHCL)(1mol/lHCL)100ml100ml，加热回，加热回流流30min(30min(从有液滴滴下开始从有液滴滴下开始计时）计时），放冷静置，抽滤，放冷静置，抽滤沉淀沉淀滤液滤液粗品槲皮素粗品槲皮素作糖的检识用作糖的检识用注意观察整个过程的现注意观察整个过程的现象！象！( 溶液澄明度和颜色溶液澄明度和颜色的变化的变化)为什么出现这种为什么出现这种情况？

13、情况？水解水解 抽滤抽滤 洗涤沉淀洗涤沉淀 干燥干燥 称重称重v具体做法：芦丁水解方法：具体做法：芦丁水解方法： 取精制芦丁取精制芦丁1.5g，研细后，研细后置于置于250ml圆底烧瓶中，加入圆底烧瓶中，加入2硫酸或硫酸或（1mol/lHCL)100m1，加热回流，加热回流 30min，瓶中浑浊，瓶中浑浊液逐渐变为澄清的棕黄色液体，最后生成鲜黄色沉淀。液逐渐变为澄清的棕黄色液体，最后生成鲜黄色沉淀。放冷沉淀，抽滤，保存滤液（放冷沉淀，抽滤，保存滤液（应为澄清无色液体应为澄清无色液体），），作为糖的检查，沉淀物为芸香苷苷元（槲皮素），作为糖的检查，沉淀物为芸香苷苷元（槲皮素），用用蒸馏水洗至中性

14、，抽干水分，晾干，称量。蒸馏水洗至中性，抽干水分，晾干，称量。得粗制槲得粗制槲皮素，再用乙醇重结晶得精制槲皮素。皮素，再用乙醇重结晶得精制槲皮素。v1mol/lHCL配法配法:取约取约90毫升浓盐酸定容至毫升浓盐酸定容至1000毫升毫升v注意观察现象：注意观察现象：未加热时，瓶内为混悬未加热时，瓶内为混悬液（液（芦丁不溶于冷水），芦丁不溶于冷水），加热后，混悬加热后，混悬液逐渐变为澄清液液逐渐变为澄清液（芦丁易溶于热水），（芦丁易溶于热水），继续加热，有继续加热，有鲜黄色沉淀析出鲜黄色沉淀析出（槲皮素不（槲皮素不溶于水）溶于水）v滤液处理滤液处理： v取芦丁水解后的滤液取芦丁水解后的滤液15m

15、1，加，加 氢氧化钡粉氢氧化钡粉中和至中性（搅拌下进行）滤去白色的硫酸中和至中性（搅拌下进行）滤去白色的硫酸钡沉淀钡沉淀(漏斗滤纸），漏斗滤纸），滤液在沸水浴上滤液在沸水浴上蒸干后，蒸干后，加加12 ml乙醇溶解，作为糖的供试液。乙醇溶解，作为糖的供试液。 （如果加（如果加 氢氧化钡加过量后可以加少量的硫氢氧化钡加过量后可以加少量的硫酸回调酸回调pH)v硫酸可以同时沉淀硫酸可以同时沉淀Ba2+ Ba2+ + SO4 2-=BaSO4 使芦丁水解后的滤液更使芦丁水解后的滤液更纯净纯净 v学生做的结果：芦丁的得率大约是：20-25%v 精制芦丁的得率是大约87%v 槲皮素占芦丁分子是：13%到20

16、思考问题思考问题1 1、纸色谱的原理及操作要点？、纸色谱的原理及操作要点？2 2、黄酮类化合物有哪些显色方法，各针对哪类黄酮？、黄酮类化合物有哪些显色方法，各针对哪类黄酮？3 3、黄酮类薄层色谱中，经常用到的吸附剂有哪几类？、黄酮类薄层色谱中，经常用到的吸附剂有哪几类？各自的原理有什么不同？各自的原理有什么不同？4 4、黄酮类薄层色谱中常用到、黄酮类薄层色谱中常用到AlClAlCl3 3乙醇溶液显色？显色乙醇溶液显色？显色后一般呈什么颜色？后一般呈什么颜色？5 5、薄层色谱的操作要点有哪些？、薄层色谱的操作要点有哪些？子项目四子项目四 芦丁和槲皮素的鉴别芦丁和槲皮素的鉴别v所需要的药品和设备：

17、氢氧化钡、葡萄糖、鼠李糖、所需要的药品和设备：氢氧化钡、葡萄糖、鼠李糖、正丁醇、乙酸、正丁醇、乙酸、苯胺、邻苯二甲酸盐、无水乙醇、甲苯胺、邻苯二甲酸盐、无水乙醇、甲醇醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸乙酯、甲酸、AlCl3、镁粉、浓盐酸、镁粉、浓盐酸、 -萘酚溶液、浓硫酸、三氯化铁、萘酚溶液、浓硫酸、三氯化铁、紫外灯、紫外灯、新新华华1号滤纸、点样毛细管、水浴锅、号滤纸、点样毛细管、水浴锅、硅胶硅胶G预制板预制板11块、分液漏斗块、分液漏斗 喷雾器几个喷雾器几个v每组需要：每组需要：1个蒸发皿、玻璃漏斗、玻璃棒、个蒸发皿、玻璃漏斗、玻璃棒、10ml试试管管8支、支、2个小烧杯、个小烧杯、胶头滴管胶头滴管

18、v需要配制的试剂需要配制的试剂:v1 苯胺苯胺邻苯二甲酸试剂配法：邻苯二甲酸试剂配法：苯胺苯胺0.93g和邻苯二甲酸和邻苯二甲酸1.66g溶于溶于100ml水饱和的正丁醇中。水饱和的正丁醇中。 （我们实验需要配（我们实验需要配100ml）(用分液漏斗中加入用分液漏斗中加入50ml水和水和 100ml正丁醇震摇后正丁醇震摇后静置取上层即为水饱和的正丁醇）静置取上层即为水饱和的正丁醇）v2 10%-萘酚乙醇溶液萘酚乙醇溶液 25mlv3 2%三氯化铁乙醇三氯化铁乙醇溶液溶液 20mlv4、展开剂：醋酸乙酯、展开剂：醋酸乙酯-甲酸甲酸-水（水（8：1：1）（我们实验需要）（我们实验需要配配300ml

19、v5、5组配一瓶配组配一瓶配200ml正丁醇正丁醇-乙酸乙酸-水（水（4：1：5）放到分液）放到分液漏斗中，平衡后取上层备用漏斗中，平衡后取上层备用v配两瓶配两瓶v6、 2%AlCl3乙醇溶液乙醇溶液 100mlv7、硅胶预制板，用之前、硅胶预制板，用之前105度烘半个小时。度烘半个小时。子项目三子项目三 芦丁芦丁和槲皮素的鉴别和槲皮素的鉴别芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定水解所得滤液水解所得滤液20ml20ml用饱和用饱和Ba(OH)Ba(OH)2 2调调PHPH值至中值至中性，折叠滤纸过滤性，折叠滤纸过滤残渣残渣滤液滤液蒸干，放冷蒸干，放冷加加2-3ml2-3ml乙醇溶解乙醇溶解供

20、试品溶液供试品溶液纸色谱纸色谱糖糖的的鉴鉴定定糖糖的的纸纸色色谱谱鉴鉴定定标准品：葡萄糖、鼠李糖标准品：葡萄糖、鼠李糖展开剂：正丁醇展开剂：正丁醇- -乙酸乙酸- -水（水（4 4：1 1：5 5）上层液）上层液显色剂：苯胺显色剂：苯胺邻苯二甲酸试剂。邻苯二甲酸试剂。 105105烘烘10min10min显色显色( (显棕色或棕红色斑点显棕色或棕红色斑点) ) 芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定新华一号滤纸新华一号滤纸标本缸标本缸倒入缸内约倒入缸内约3030毫升的展开剂毫升的展开剂糖糖的的纸纸色色谱谱鉴鉴定定标准品：葡萄糖、鼠李糖标准品：葡萄糖、鼠李糖展开剂：正丁醇展开剂：正丁醇- -乙

21、酸乙酸- -水（水（4 4：1 1：5 5）放到分液）放到分液漏斗中，平衡后取上层备用。漏斗中，平衡后取上层备用。 显色剂：苯胺显色剂：苯胺邻苯二甲酸试剂。邻苯二甲酸试剂。 105105烘烘10min10min显色显色( (显棕色或棕红色斑点显棕色或棕红色斑点) ) 芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定试验记录：试验记录： 当溶剂走到溶剂前沿当溶剂走到溶剂前沿68cm即可，约需即可，约需40分钟分钟粘附纸色谱，并计算斑点的f值芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定定定性性反反应应芦丁供试品溶液：芦丁供试品溶液：取精制芦丁约取精制芦丁约5mg，用，用5ml甲甲醇（无水乙醇）使溶液，备用。醇

22、（无水乙醇）使溶液，备用。槲皮素供试品溶液：槲皮素供试品溶液：取粗槲皮素约取粗槲皮素约5mg，用，用5ml甲醇甲醇（无水乙醇）（无水乙醇）使溶液，备用。使溶液，备用。其余试剂：其余试剂：镁粉、浓盐酸、镁粉、浓盐酸、10%-10%-萘酚溶液、浓硫酸、萘酚溶液、浓硫酸、2%2% 三氯化铁乙醇溶液三氯化铁乙醇溶液 准备准备3 3支试管（一个空白管，支试管（一个空白管，样品用蒸馏水代替，一个是样品用蒸馏水代替，一个是芦丁、一个是槲皮素芦丁、一个是槲皮素）试验记录试验记录定定性性反反应应盐酸盐酸- -镁粉反应镁粉反应 将样品溶液将样品溶液1ml1ml，先滴加，先滴加1 12 2滴浓盐酸再加入少许滴浓盐酸

23、再加入少许镁粉振摇，镁粉振摇，1-2min1-2min内，观察颜色变化。（注意顺序）内，观察颜色变化。（注意顺序）MolishMolish反应反应 将样品溶液将样品溶液1ml1ml，加入与样品等体积加入与样品等体积10%-10%-萘萘酚溶液，倾斜试管，摇匀，酚溶液，倾斜试管，摇匀，沿管壁滴加适量浓硫沿管壁滴加适量浓硫酸（约酸（约2 2ml），至分层，至分层注意观察两界面产生的变注意观察两界面产生的变化。（不要摇动）化。（不要摇动）黄酮母核黄酮母核苷类苷类芦丁的提取分离与鉴定芦丁的提取分离与鉴定FeClFeCl3 3反应反应酚羟基酚羟基 将样品溶液将样品溶液1ml1ml，加入，加入1 12 2滴

24、滴2%Fecl2%Fecl3 3溶液，溶液，观察现象。观察现象。薄薄层层色色谱谱鉴鉴别别样品：分别取精制的芦丁、槲皮素适量，加样品：分别取精制的芦丁、槲皮素适量，加95%95%乙乙醇溶解成每醇溶解成每1ml1ml含含1mg1mg的溶液，备用。的溶液，备用。展开剂：醋酸乙酯展开剂：醋酸乙酯- -甲酸甲酸- -水（水（8 8：1 1：1 1）显色剂：显色剂：2%AlCl2%AlCl3 3乙醇溶液，乙醇溶液，105105加热至斑点加热至斑点清晰，置紫外灯清晰，置紫外灯(365nm)(365nm)下观察。下观察。 芦丁的提取与定性反应芦丁的提取与定性反应实验记录实验记录v注意：硅胶预制板，用之前注意：硅胶预制板，用之前105度烘半个小度烘半个小时。时。实验规则实验规则要明确实验目的与要求。对处方要明确实验目的与要求。对处方中药物性质、配制原理、操作步骤、操作关键等，中药物性质、配制原理、操作步骤、操作关键等，做到做到“心中有数心中有数”，并合理安排实验时间。，并合理安排实验时间。 应保持实验室内肃静，不得无故应保持实验室内肃静，不得无故迟到或早退，不得擅离实验操作岗位，甚至高声迟到或早退，不得擅离实验操作岗位，甚至高声谈笑。如发生差错事故或异常现象，应随时报告谈笑。如发生差错事故或异常现象，应随时报告指导教师，查明原因，及时解释。注意安全，严指导教师，查明原因，及时解释。注意安全