生物技术概论-基因工程

1、 基因工程操作的一般步骤基因工程操作的一般步骤 1 1、目的基因获得：取得编码人们目标性状要求的、目的基因获得：取得编码人们目标性状要求的DNADNA片段片段即基因；即基因； 2 2、目的基因克隆（复制）与验证、目的基因克隆（复制）与验证 3 3、目的基因表达载体构建：将目的基因与质粒载体或病、目的基因表达载体构建：将目的基因与质粒载体或病毒载体连接成能够在生物中表达的重组毒载体连接成能够在生物中表达的重组 DNADNA； 4 4、转化：把重组、转化：把重组DNADNA引入某种受体生物或细胞；引入某种受体生物或细胞； 5 5、筛选：从大量的受体中筛选出可能具有目的基因的个、筛选：从大量的受体中

2、筛选出可能具有目的基因的个体或细胞挑选出来。体或细胞挑选出来。 第三节第三节 基因工程上游技术基因工程上游技术基因片段的获得、验证和表达载体构建基因片段的获得、验证和表达载体构建为体外为体外DNADNA重组，一般认为是基因工程的重组，一般认为是基因工程的上上游技术；游技术；转化和转化体筛选主要是进行目的基因转化和转化体筛选主要是进行目的基因向目标生物体内的转移、体内重组和重组向目标生物体内的转移、体内重组和重组体筛选鉴定，称为基因工程的体筛选鉴定，称为基因工程的下游技术。下游技术。 目的基因片段获得目的基因片段获得克隆载体克隆载体( (空空) )目的基因克隆载体目的基因克隆载体基因克隆验证基因

3、克隆验证切出片段切出片段插入片段测序验证插入片段测序验证NY表达载体表达载体( (空空) )目的基因表达载体目的基因表达载体表达载体验证表达载体验证N表达载体表达载体构建构建Y基因片段获得基因片段获得Y导入工程菌或病毒导入工程菌或病毒直接转化直接转化介导生物验证介导生物验证YN生物介导转化生物介导转化转化转化目的基因DNA检测目的基因RNA检测目的Protein检测Protein 活性检测室内室内田间功能验证田间功能验证受体抗性筛选受体抗性筛选YNN筛选筛选一一、目的基因的获得、目的基因的获得1 1、目的基因、目的基因基因工程中用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因。基因工程中用来改造生

4、物个体或用于生产某种产物的有用基因。2 2、目的基因获得方法、目的基因获得方法 （1）化学合成法：按照预先设计的化学合成法：按照预先设计的DNADNA序列，通过化学反应合成目的序列，通过化学反应合成目的基因片段的方法。基因片段的方法。 合成方向：合成方向：3-53-5 合成长度：合成长度：10-500bp10-500bp 优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高 缺点：合成长度有限，设备昂贵缺点：合成长度有限，设备昂贵乙腈亚磷酸胺化学合成法乙腈亚磷酸胺化学合成法Step1：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（DM

5、Tr基）基） 反应，用以准备附加下一个新的碱基。反应，用以准备附加下一个新的碱基。 Step2：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。 Step3：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。 Step4：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反应失败部分）加帽封死（应失败部分）加帽封死（Capping反应反应)，不让其进行进一，不让其进行进一步延伸反应。步延伸反应。 Step5：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，使

6、应，使3价磷变成价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。如需价磷，使合成产物变得更加稳定。如需进一步合成延伸碱基时，再回到进一步合成延伸碱基时，再回到Step1进行合成。如此循环进行合成。如此循环往复，可以不断合成往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列碱基，直至合成完所需序列 Step6：从：从CPG担体上用氨水切离合成终了的担体上用氨水切离合成终了的Oligo DNA。（2 2） PCRPCR法：参照已知基因序列，在该基因序列法：参照已知基因序列，在该基因序列保守区域设计两个引物，用保守区域设计两个引物，用PCRPCR反应获得两个反应获得两个引物之间该基因引物之间该基因DNADNA

7、序列的方法。序列的方法。 引物来源：已知基因序列引物来源：已知基因序列 片段获得：片段获得：PCRPCR 优点：操作容易、目的性强优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因，含内含子差的基因，含内含子 (3)RT-PCR (3)RT-PCR法：参照已知基因序列，在该基因序法：参照已知基因序列，在该基因序列保守区域设计两个引物，用列保守区域设计两个引物，用PCRPCR反应获得两个引反应获得两个引物之间该基因编码序列物之间该基因编码序列(mRNA)(mRNA)的方法。的方法。 引物来源：已知基因序列引物来源：已知基因序列 片段获得：片

8、段获得：RT-PCRRT-PCR 优点：操作容易、目的性强优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因（4 4）基因组文库法：将基因组）基因组文库法：将基因组DNADNA切割成片段后切割成片段后，直接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中，直接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中查找有用克隆的编码序列的方法。查找有用克隆的编码序列的方法。 片段切割：识别序列为片段切割：识别序列为4 4碱基的限制性内切酶碱基的限制性内切酶 克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体 优点：能够获得未知基因，能够

9、对基因组所有基因进行研究优点：能够获得未知基因，能够对基因组所有基因进行研究 缺点缺点: :序列含内含子序列含内含子, ,基因通用性较差基因通用性较差 （5）cDNAcDNA文库法：以生物体内文库法：以生物体内mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA后直接克隆构建成后直接克隆构建成cDNAcDNA文库，从中查找有用基因的文库，从中查找有用基因的方法。方法。 片段来源：片段来源：mRNAmRNA逆转录逆转录 克隆载体：质粒载体克隆载体：质粒载体 优点：便于获得表达的基因的序列，获得得优点：便于获得表达的基因的序列，获得得序列为编码序列无内含子，费用较低序列为编码序列无内含子，费用较低 缺点：无法

10、获得未表达或表达水平较低基因缺点：无法获得未表达或表达水平较低基因 （六）T-DNA标签法（七）mRNA差异显示法（八）反向克隆法二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆在获得了目的基因片段后，为了在获得了目的基因片段后，为了便于下一步操作，常需将该片段克隆便于下一步操作，常需将该片段克隆到克隆载体上，进行大量复制，并验到克隆载体上，进行大量复制，并验证该片段序列是否正确。证该片段序列是否正确。 ( (一一) )克隆定义：克隆定义：1 1克隆克隆( (名词名词) )：通过无性繁殖形成的与其：通过无性繁殖形成的与其亲本一致的生物群体。亲本一致的生物群体。2 2克隆克隆( (动词动词) )：生物的无性

11、繁殖。：生物的无性繁殖。3. 3. 基因克隆：将目的基因片段连接到克隆基因克隆：将目的基因片段连接到克隆载体上并进行大量复制的过程。载体上并进行大量复制的过程。 ( (二二) )基因克隆步骤基因克隆步骤1 1、目的基因片段的获得：、目的基因片段的获得：PCRPCR、酶切获得、酶切获得2 2、目的基因片段的分离纯化：、目的基因片段的分离纯化： 电泳：分离电泳：分离 回收：从胶内提取、纯化并定量。回收：从胶内提取、纯化并定量。3 3、目的基因片段与克隆载体连接：、目的基因片段与克隆载体连接： 平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段的平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段

12、的连接。连接。 粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。 T/AT/A克隆：经常规克隆：经常规PCRPCR反应获得的片段的连接。反应获得的片段的连接。4 4、目的基因片段重组克隆载体筛选验证、目的基因片段重组克隆载体筛选验证5 5、目的基因片段复制(三三)基因基因重组克隆重组克隆筛选筛选 将已经连接外源基因的载体将已经连接外源基因的载体(DNA)(DNA)向受体生物向受体生物细胞中导入，从大量的受体中筛选出成功导入目细胞中导入，从大量的受体中筛选出成功导入目的基因克隆载体的个体，称的基因克隆载体的个体，称为重组克隆筛选为重组克隆筛选。 一般克隆载

13、体的受体生物为大肠杆菌。常用一般克隆载体的受体生物为大肠杆菌。常用的筛选方法有两种：的筛选方法有两种： 1 1、抗生素抗性筛选、抗生素抗性筛选 2 2、菌落蓝、白斑筛选、菌落蓝、白斑筛选 pUC19筛选结果模式图(四四)载体上载体上插入基因片段的验证插入基因片段的验证1 1、DNADNA酶切法酶切法 2 2、PCRPCR法法3 3、DNADNA测序法测序法 模板模板+dNTP+测序引物测序引物+测序测序Taq酶酶ddATPddTTPddGTPddCTP三、目的基因的表达载体构建三、目的基因的表达载体构建 目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受体生物的基

14、因表达载体。体生物的基因表达载体。 表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框架架(编码序列编码序列)插入适宜的表达载体插入适宜的表达载体(空空)的启动子、终的启动子、终止子中间，形成表达框架。止子中间，形成表达框架。 表达框架：表达框架：启动子启动子-目的基因的目的基因的ORF-终止子终止子 1 1、表达载体的作用：表达载体的作用：使该基因能够被使该基因能够被导入新的生物体、进行自主或整合复制并导入新的生物体、进行自主或整合复制并在生物体中启动和表达。在生物体中启动和表达。 一般情况下有三个串联的表达框架：一般情况下有三个串联的表达框架：-1-2-3-

15、1、启动子、启动子-抗性基因的抗性基因的ORF-终止子终止子 2、启动子启动子-目的基因的目的基因的ORF-终止子终止子 3、启动子、启动子-报告基因的报告基因的ORF-终止子终止子抗性基因：抗性基因：Npt II：新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素 Hyg: 潮霉素磷酸转移酶基因潮霉素磷酸转移酶基因, ,抗潮霉素抗潮霉素 gentR:庆大霉素抗性庆大霉素抗性 基因基因，抗庆大霉素抗庆大霉素 AmpAmpR:氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类 TETR:四环素抗性基因四环素抗性基因,抗四环素抗四环素报告基因：报告基因：Gus:催化溴取代葡

16、萄糖转化无色催化溴取代葡萄糖转化无色-蓝色反应蓝色反应 Gfp:绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白 Lac（z）:催化溴取代半乳糖无色催化溴取代半乳糖无色-蓝色转化反应蓝色转化反应常用选择标记常用选择标记(编码基因编码基因):2 2、生物表达系统的特异性、生物表达系统的特异性 不同生物中，启动基因的表达需要不同的启不同生物中，启动基因的表达需要不同的启动子，在原核生物中，需要原核生物启动子和终止动子，在原核生物中，需要原核生物启动子和终止子；在植物中，需要适合植物的启动子和终止子。子；在植物中，需要适合植物的启动子和终止子。 在原核生物中，经常使用的启动子有：在原核生

17、物中，经常使用的启动子有：T3T3、T7T7和和SP6SP6启动子。启动子。 在植物中，经常使用的启动子有：在植物中，经常使用的启动子有：CaMV 35SCaMV 35S启启动子，胭脂碱合成酶基因终止子。动子，胭脂碱合成酶基因终止子。 3 3、植物表达载体系统、植物表达载体系统目前常用的植物表达载体系统有：目前常用的植物表达载体系统有： 1、质粒载体系统：、质粒载体系统： 2、病毒载体系统：、病毒载体系统：根癌农杆菌及其质粒Ti质粒Vir:毒区，切割、转运、侵染区毒区，切割、转运、侵染区 T-DNA区：被转移整合到植物的区：被转移整合到植物的DNA区域区域LB:左边界左边界 RB：右边界：右边

18、界 把目的基因表达框架整合到改造后的把目的基因表达框架整合到改造后的Ti质质粒粒( (卸甲质粒卸甲质粒) )的的T-DNAT-DNA区域形成的质粒载体。区域形成的质粒载体。 所有基因转移、基因表达元件位于同一质所有基因转移、基因表达元件位于同一质粒上，称为一元表达载体。但这类载体构建困粒上，称为一元表达载体。但这类载体构建困难，目的基因整合概率较低。难，目的基因整合概率较低。 改造改造TiTi质粒：取代致瘤和不必要的基因。质粒：取代致瘤和不必要的基因。 1 1）一元载体系统（整合载体系统）一元载体系统（整合载体系统）Ti质粒Vir:区区:环化成辅助质粒环化成辅助质粒T-DNA区：环化成微型区：

19、环化成微型Ti-质粒质粒 它由微型它由微型Ti质粒（质粒（mini-Ti plasmid）和辅助）和辅助Ti质粒质粒（helper Ti plasmid）两个独立的质）两个独立的质粒粒构成。构成。 辅助质粒：辅助质粒： 提供提供Vir基因的转移、切割、拼接功能基因的转移、切割、拼接功能 微型微型Ti质粒：含有质粒：含有T-DNA边界、为一个广谱质粒，提供用边界、为一个广谱质粒，提供用于转移的基因表达框架。于转移的基因表达框架。 2 2）双元载体系统）双元载体系统binary vectorbinary vector(三三)构建过程构建过程1 1片段获得：酶切法片段获得：酶切法2 2表达载体线性化

20、：酶切法表达载体线性化：酶切法3 3、片段分离纯化：电泳、条带回收、片段分离纯化：电泳、条带回收4 4连接：基因片段和载体连接：基因片段和载体DNADNA定向定向连接。连接。 (四四)表达载体验证表达载体验证标记基因筛选标记基因筛选 酶切鉴定法酶切鉴定法 PCRPCR鉴定法鉴定法DNADNA杂交：斑点杂交、菌落原位杂交杂交：斑点杂交、菌落原位杂交。( (五五) )工程菌构建工程菌构建 表达载体：直接转化。表达载体：直接转化。 工程菌构建：生物介导转化。把表达载体转入介导生物中。工程菌构建：生物介导转化。把表达载体转入介导生物中。一、基因转移一、基因转移 把外源把外源DNADNA导入生物体，使生

21、物体发生某导入生物体，使生物体发生某种变化的过程称为转化种变化的过程称为转化(Transformation)(Transformation)。 把一种生物的基因导入到另外一个生物把一种生物的基因导入到另外一个生物体内的过程称为基因转移体内的过程称为基因转移(gene transfer)(gene transfer)。第四节第四节 基因工程下游技术基因工程下游技术（一）植物受体系统（一）植物受体系统受体受体: :用于接收外源基因片段的用于接收外源基因片段的生物个体、细胞或者组织。生物个体、细胞或者组织。 1 1、植物组织：、植物组织： 2 2、原生质体：、原生质体： 3 3、生殖细胞：、生殖细胞

22、： 1 1、植物组织：、植物组织：受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些些病毒或质粒上的某些DNADNA通过各种不同的方式转移通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。 2 2、原生

23、质体：、原生质体： 原生质体是植物细胞除去细胞壁后的部分，是原生质体是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的一个质膜包围的“裸露细胞裸露细胞”。 原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。生成完整植株的能力，具有全能性。 原生质体比较容易完成一系列细胞操作或遗传原生质体比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，而且还可以直接高效的捕获外源基因。操作，而且还可以直接高效的捕获外源基因。 嵌合体少，遗传稳定性更差，培养周期长，难嵌合体少，遗传稳定性更差，培养周期长，难度大，再生频率低。度大，再生频率低。3 3、生殖细胞：、生殖

24、细胞： 是以植物生殖细胞如：花粉细胞、卵细胞是以植物生殖细胞如：花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。为受体细胞进行基因转化的系统。 目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用花粉细胞和卵细胞培养，从因转化：一是利用花粉细胞和卵细胞培养，从而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化花粉和卵细胞受精过程进行基因转化 优点优点: : 一旦将外源基因导入这些细胞，一旦将外源基因导入这些细胞，可以遗可以遗传，传，利用植物自身的受粉过程，具有操作方利用植物自身的受粉过程，具有操作方

25、法方便、简单。法方便、简单。缺点缺点: : 不足受到季节的限制；只能花期进行，不足受到季节的限制；只能花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。且无性繁殖的植物不能采用。 （二）直接转化法（二）直接转化法直接将纯化的携带有外源基因的直接将纯化的携带有外源基因的DNADNA导入生物体的方法导入生物体的方法。根据所采用的原理，可以分为：。根据所采用的原理，可以分为： 物理转化法、物理转化法、 化学转化法、化学转化法、 种质介导转化法。种质介导转化法。 1.1.物理转化法：物理转化法： 通过物理方法打开细胞屏障通过物理方法打开细胞屏障( (细胞壁和细胞膜细胞壁和细胞膜) )，将外源基因直接导入生物体的方法

26、。将外源基因直接导入生物体的方法。 (1)(1)电激法电激法( (电穿孔法电穿孔法) )： (2)(2)超声法超声法( (超声穿孔法超声穿孔法) )： (3)(3)热激法：热激法： (4)(4)显微注射法：显微注射法： (5)(5)激光法激光法( (激光穿孔法激光穿孔法) ) (6) (6)基因枪法基因枪法( (微弹法微弹法) ) (1)(1)电激法电激法( (电穿孔法电穿孔法) )： 细胞膜在适当的外加电压作用下，细胞膜细胞膜在适当的外加电压作用下，细胞膜被击穿，细胞周围的溶液中的外源被击穿，细胞周围的溶液中的外源DNA分子会分子会通过这些孔洞进入细胞中。移去外加电压后，通过这些孔洞进入细胞

27、中。移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动修复，外源基因进膜孔在一定时间内可以自动修复，外源基因进入细胞内后少数可能会整合到染色体上。入细胞内后少数可能会整合到染色体上。 利用这一原理，将原生质体与外源基利用这一原理，将原生质体与外源基因混合置于电激仪的样品小室中，然后在因混合置于电激仪的样品小室中，然后在一定的电压下进行短时间直流电脉冲，电一定的电压下进行短时间直流电脉冲，电击后的原生质体被转移至培养基中培养，击后的原生质体被转移至培养基中培养，根据选择标记筛选带有标记基因的转化子。根据选择标记筛选带有标记基因的转化子。 超声穿孔法超声穿孔法、热激法热激法、显微注射法显微注射法、激光法激光

28、法原理与此相同原理与此相同物理转化法步骤：1、目的基因表达载体DNA溶液配制2、受体细胞准备(原生质体制备)3、物理法导致细胞穿孔4、细胞恢复培养和筛选基因枪法(微弹法)2.2.化学转化法化学转化法(1)(1)聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)法法 PEGPEG与多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等多聚物和与多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等多聚物和二价阳离子（如二价阳离子（如MgMg2+2+、CaCa2+2+、MnMn2+2+）及）及DNADNA常在常在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吸作用而被吸收。内吸作用而被吸收。 利用利用PEGPEG诱导原生质体融合时要求

29、原生质诱导原生质体融合时要求原生质体具有较高的活力。体具有较高的活力。(2)(2)脂质体法脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过内吞作用而进入细胞。种解释是通过内吞作用而进入细胞。 3.种质介导转化法种质介导转化法(1)花粉管通道法花粉管通道法 是我国科学家周光宇等首次提出外源是我国科学家周光宇等首次提出外源DNA导入植物的转基因技术。导入植物的转基因技术。 其基本原理是授粉后使外源其基本原理

30、是授粉后使外源DNA能沿着能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化还花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化还不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞 (2)生殖细胞浸泡法生殖细胞浸泡法 生殖细胞生殖细胞(种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花药悬浮细胞培养物等药悬浮细胞培养物等)直接浸泡在外源直接浸泡在外源DNA溶液中，溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体并整合和遗传的利用渗透作用把外源基因导入受体并整合和遗传的方法。方法。(3)胚囊、子房注射法胚囊、子房注射法 使用显微注射仪把外源基因溶液注射到子房或使用显微注射仪把外源

31、基因溶液注射到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生的压力和卵细胞的胚囊中，由于子房或胚囊中产生的压力和卵细胞的吸收使外源吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。基因植株。 （三）间接转化法（三）间接转化法(生物转化法生物转化法)1.农杆菌介导法农杆菌介导法 有两种农杆菌有两种农杆菌:根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）发根农杆菌发根农杆菌(A. Rhizogenes) 被广泛用于植物转基因。被广泛用于植物转基因。 原理：农杆菌在适宜条件下原理：农杆菌在适宜条件下(酸性酸性,酚类诱导物如乙酰丁香酚类诱导物如乙酰丁

32、香酮酮)，将其质粒，将其质粒T-DNA部分可以转入植物细胞并插入到植物基部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。因组中。 2.病毒介导法病毒介导法 病毒通过膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用或病毒通过膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用或细胞内吞进入宿主细胞，经反转录合成细胞内吞进入宿主细胞，经反转录合成DNA并随机整合到并随机整合到宿主基因组中。可介导转基因的病毒宿主基因组中。可介导转基因的病毒: (1) (1)双链双链DNADNA病毒病毒 CaMVCaMV花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒 DaMVDaMV大丽花花叶病毒大丽花花叶病毒 CEKVCEKV石竹饰刻斑纹病毒石竹饰刻斑纹病毒 (2)

33、(2)单链单链DNADNA病毒病毒 (3)(3)单链单链RNARNA病毒病毒 症状（四）农杆菌介导转化法（四）农杆菌介导转化法A、整体植株接种共感染法整体植株接种共感染法1 1、原理与方法：、原理与方法：该途径是模仿自然界农杆菌天然的转化过程，人为的在植该途径是模仿自然界农杆菌天然的转化过程，人为的在植株上造成创伤部位，然后把携带目的基因表达载体的农杆菌株上造成创伤部位，然后把携带目的基因表达载体的农杆菌接种在创伤面上或植株体内，使农杆菌在植株内进行侵染转接种在创伤面上或植株体内，使农杆菌在植株内进行侵染转化，获得转化的植物细胞，因此也称为体内转化。化，获得转化的植物细胞，因此也称为体内转化。

34、2 2、受体材料：、受体材料：无菌苗、种子实生苗无菌苗、种子实生苗3 3、优点：试验周期短、具有较高的转化效率、优点：试验周期短、具有较高的转化效率、4 4、缺点：嵌合体多、筛选困难、缺点：嵌合体多、筛选困难B、叶盘转化法叶盘转化法 1 1、原理和方法：、原理和方法： 为了诱导农杆菌的侵染活性，把无菌苗叶片剪切成圆形为了诱导农杆菌的侵染活性，把无菌苗叶片剪切成圆形或方形叶盘，人为地造成较大的伤口或方形叶盘，人为地造成较大的伤口/ /面积比，叶盘浸蘸接种面积比，叶盘浸蘸接种农杆菌后，与农杆菌共培养一段时间后，目的基因可经农杆农杆菌后，与农杆菌共培养一段时间后，目的基因可经农杆菌整合到植物染色体上

35、，经转接到脱菌培养基上除去农杆菌菌整合到植物染色体上，经转接到脱菌培养基上除去农杆菌，经筛选后可得转化植株。，经筛选后可得转化植株。 2 2、受体材料：、受体材料： 无菌苗叶片。无菌苗叶片。 3 3、优点：、优点： 适用性广、重复性好适用性广、重复性好 缺点：部分材料叶盘再生困难。缺点：部分材料叶盘再生困难。 C、原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法1 1、原理同上、原理同上2、受体材料原生质体3、优点：易转化、无嵌合体4、缺点：再生困难常用植物基因转化方法特点比较评价条件评价条件农杆菌农杆菌PEGPEG法法电击法电击法注射注射法法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法受体材料受体材料组

36、织、组织、原 生 质原 生 质体体原生质原生质体体原 生 质原 生 质体体原生原生质体质体组织、细组织、细胞胞卵细胞卵细胞寄主范围寄主范围有有无无无无无无无无有性繁殖材料有性繁殖材料组培条件组培条件简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单不需要不需要转化率转化率1-10%1-10%1010-5-4-5-41010-5-4-5-41010-3-2-3-21010-3-2-3-210%1010%10嵌 合 体 比嵌 合 体 比例例有有无无无无无无多多无无操 作 复 杂操 作 复 杂性性简单简单简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单设备要求设备要求简单简单简单简单昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵简单简单工

37、作效率工作效率高高低低低低低低高高低低单 子 叶 植单 子 叶 植物物少少可行可行可行可行可行可行广泛广泛广泛广泛大麦转化示意图二二 、转移植株筛选、转移植株筛选1、抗性筛选、抗性筛选2、报告基因筛选、报告基因筛选3、DNA检测检测4、RNA检测检测5、蛋白质检测、蛋白质检测6、功能检测、功能检测第五节第五节 植物转基因改良的应用植物转基因改良的应用一、抗虫改良一、抗虫改良1、常用常用抗虫基因抗虫基因可分为三类可分为三类:(1)细菌中分离的抗虫基因细菌中分离的抗虫基因,主要是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白主要是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因基因;(2)植物中分离的抗虫基因植物中分离的抗虫基因,主要

38、为蛋白酶抑制剂基因、淀粉主要为蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因酶抑制剂基因、外源凝集素基因(Lec)等等,应用最广泛的是豇豆应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI);(3)从昆虫从昆虫中中分离的分离的抗虫抗虫基因基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。基因等。2 2、杀虫原理、杀虫原理(1)BT(1)BT基因基因 BtBt基因又称杀虫结晶蛋白基因又称杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal (insecticidal crystal protein. ICP)protein. ICP)基因基因, , 来自于苏云

39、金芽孢杆菌来自于苏云金芽孢杆菌, ,其杀虫毒性来自其杀虫毒性来自芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白( (或或内毒素内毒素) )。 原理原理: :破坏昆虫的消化系统破坏昆虫的消化系统. .这种蛋白通常以原毒素形式这种蛋白通常以原毒素形式存在存在, ,当昆虫取食后当昆虫取食后, ,原毒素在消化道内被活化，破坏肠道细胞原毒素在消化道内被活化，破坏肠道细胞膜上的特异性结合蛋白膜上的特异性结合蛋白, , 使细胞膜产生一些孔道。使细胞膜产生一些孔道。 目前常见的目前常见的btbt基因分为基因分为7 7类，共类，共3030多个小多个小类，分别可以抗鳞翅目、膜翅目、双翅目、类，分

40、别可以抗鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目害虫以及线虫，有些种类具有多种昆鞘翅目害虫以及线虫，有些种类具有多种昆虫抗性。虫抗性。 抗虫棉基因的转化过程70由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。(2)胰蛋白酶抑制剂基因胰蛋白酶抑制剂基因 植物中存在三类蛋白酶抑制剂：植物中存在三类蛋白酶抑制剂： 丝氨酸蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂 巯基蛋白酶抑制剂巯基蛋白酶抑制剂 金属蛋白酶抑制剂。金属蛋白酶抑制剂。 其中丝氨酸蛋白酶抑制剂中的豇豆胰蛋白酶抑其中丝氨酸蛋白酶抑制

41、剂中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因制剂基因(CpTI)是目前研究得较为深入且应用最为是目前研究得较为深入且应用最为广泛的基因。广泛的基因。 蛋白酶抑制剂杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫机理: : 蛋白酶抑制剂与昆虫消化道的蛋白酶相结合蛋白酶抑制剂与昆虫消化道的蛋白酶相结合, ,形形成酶成酶- -抑制剂复合物抑制剂复合物, ,使酶活性中心失活使酶活性中心失活, ,从而阻断或从而阻断或减弱酶的水解作用减弱酶的水解作用, ,干扰昆虫对外来蛋白的正常消化干扰昆虫对外来蛋白的正常消化, , 最终造成昆虫非正常发育或死亡。最终造成昆虫非正常发育或死亡。 (3)植物凝集素基因植物凝集素基因(Lec) 植物凝集素是植物体普

42、遍存在的一类保守性很植物凝集素是植物体普遍存在的一类保守性很强的非免疫性蛋白强的非免疫性蛋白,能特异性识别并可逆地结合糖能特异性识别并可逆地结合糖蛋蛋白白的糖基部分。的糖基部分。 麦胚凝集素麦胚凝集素(WGA),对欧洲玉米螟有良好的抗性。对欧洲玉米螟有良好的抗性。雪莲花凝集素雪莲花凝集素(GNA)对蚜虫、叶蝉、稻飞虱等同对蚜虫、叶蝉、稻飞虱等同翅目吸食性害虫有极强的毒性。翅目吸食性害虫有极强的毒性。豌豆外凝集素豌豆外凝集素(p-Lec)能抑制豇豆象的生长。能抑制豇豆象的生长。 作用机理作用机理: : 当昆虫取食外凝集素后当昆虫取食外凝集素后, ,外源凝集素在昆虫消外源凝集素在昆虫消化道周围的细

43、胞膜糖蛋白专一性结合化道周围的细胞膜糖蛋白专一性结合, ,从而影响所有从而影响所有营养的吸收营养的吸收, ,达到抗虫目的。达到抗虫目的。(4)(4)淀粉酶抑制剂淀粉酶抑制剂 淀粉酶抑制剂能抑制昆虫消化道内淀粉酶抑制剂能抑制昆虫消化道内-淀粉酶淀粉酶活性活性, ,使食入的淀粉无法水解使食入的淀粉无法水解, ,阻断了昆虫主要能量阻断了昆虫主要能量来源；来源； 它与淀粉酶形成的酶它与淀粉酶形成的酶- -抑制剂复合物通过生理反抑制剂复合物通过生理反馈调节作用馈调节作用, ,刺激昆虫分泌过量的消化酶刺激昆虫分泌过量的消化酶, ,产生厌食产生厌食反应。反应。 (5)(5)昆虫毒素基因昆虫毒素基因 昆虫神经

44、毒素控制着昆虫许多关键的生理过程昆虫神经毒素控制着昆虫许多关键的生理过程, ,影响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等影响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等, ,近年近年来来, ,人们已开始在基因工程中利用昆虫神经毒素防治人们已开始在基因工程中利用昆虫神经毒素防治害虫。害虫。 目前目前, ,蝎毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒蝎毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素已被用于植物抗虫基因工程。素已被用于植物抗虫基因工程。 由于每一种抗虫基因都有其局限性由于每一种抗虫基因都有其局限性,近年近年来正在研究或已应用于抗虫基因工程的基因来正在研究或已应用于抗虫基因工程的基因还有胆固醇氧化酶基因、营养杀虫

45、蛋白基因、还有胆固醇氧化酶基因、营养杀虫蛋白基因、几丁质酶基因、核糖体失活蛋白基因和异戊几丁质酶基因、核糖体失活蛋白基因和异戊烯转移酶基因等。烯转移酶基因等。 ( (二二) )抗真菌病改良抗真菌病改良1、抗真菌病基因、抗真菌病基因根据植物的防卫机制和病原菌致病机理，已知的根据植物的防卫机制和病原菌致病机理，已知的植物抗真菌病基因主要有以下两个方面：植物抗真菌病基因主要有以下两个方面： 一是细胞壁结构增强基因，一是细胞壁结构增强基因， 二是生成抗菌物质或激活抗菌物质活性的基因二是生成抗菌物质或激活抗菌物质活性的基因 第一类基因目前应用较少，第二类基因已经开第一类基因目前应用较少，第二类基因已经开

46、始大量应用。始大量应用。 2 2、主要抗真菌病基因及作用机理、主要抗真菌病基因及作用机理(1)(1)几丁质酶基因几丁质酶基因 植物和微生物中几丁质酶基因编码的降解几丁植物和微生物中几丁质酶基因编码的降解几丁质酶。几丁质是植物病原真菌的细胞壁主要成分之质酶。几丁质是植物病原真菌的细胞壁主要成分之一，几丁质的降解可以导致病原细胞死亡，也可以一，几丁质的降解可以导致病原细胞死亡，也可以诱导植物产生抗病反应。诱导植物产生抗病反应。(2)-1(2)-1，3-3-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因 -1-1，3-3-葡聚糖是植物病原真菌的细胞壁主要成葡聚糖是植物病原真菌的细胞壁主要成分之一，的降解可以导致病原细胞死

47、亡，也可以诱分之一，的降解可以导致病原细胞死亡，也可以诱导植物产生抗病反应。导植物产生抗病反应。 (3)(3)植物抗毒素基因植物抗毒素基因 植物产生的对病原真菌具有毒性的物质，称为植物产生的对病原真菌具有毒性的物质，称为植物抗毒素，编码此类物质合成酶的基因称为植物植物抗毒素，编码此类物质合成酶的基因称为植物抗毒素基因。抗毒素基因。 目前已从不同科属植物中鉴定了目前已从不同科属植物中鉴定了200200多种，其中多种，其中以类黄酮和萜烯类最多。其中的关键酶如苯丙氨酸以类黄酮和萜烯类最多。其中的关键酶如苯丙氨酸裂解酶基因裂解酶基因(PAL)(PAL)已经克隆。其中芪合成酶基因已从已经克隆。其中芪合成

48、酶基因已从葡萄、花生等植物中克隆并转入烟草中获得了抗病葡萄、花生等植物中克隆并转入烟草中获得了抗病性植株。性植株。 (4)核糖体抑制蛋白基因核糖体抑制蛋白基因(Ribosome inhibiting protein, RIP) 核糖体抑制蛋白是来源于植物能作用于其他远缘核糖体抑制蛋白是来源于植物能作用于其他远缘真核生物核糖体、抑制蛋白质合成的蛋白毒素。现已真核生物核糖体、抑制蛋白质合成的蛋白毒素。现已经从大麦中分离了经从大麦中分离了RIP并在体外抑制了真菌的活性。并在体外抑制了真菌的活性。(5)过氧化物酶基因过氧化物酶基因 参与苯丙烷代谢，形成木质素、植保素及细胞壁参与苯丙烷代谢，形成木质素、

49、植保素及细胞壁酚类物质。酚类物质。 ( (三三) )抗细菌性病害改良抗细菌性病害改良1 1、抗菌肽基因、抗菌肽基因 抗菌肽是一类从动物、植物中分离得到的具有抗菌活性并抗菌肽是一类从动物、植物中分离得到的具有抗菌活性并且同源性较高的小分子多肽。抗菌肽由且同源性较高的小分子多肽。抗菌肽由3030多个氨基酸擦残基多个氨基酸擦残基组成，分子量大约为组成，分子量大约为4kd4kd，杀菌肽具有双亲性的，杀菌肽具有双亲性的螺旋结构，螺旋结构，是杀菌肽破坏膜活性的关键。杀菌肽具有光谱抗菌性，主要分是杀菌肽破坏膜活性的关键。杀菌肽具有光谱抗菌性，主要分为为A A、B B、D D三种形式，其中三种形式，其中A A

50、、B B特别对革兰氏阴性菌有强大特别对革兰氏阴性菌有强大的杀伤力的杀伤力2 2、溶菌酶基因、溶菌酶基因 溶菌酶能够溶解细菌细胞外一些多糖之间的糖苷键，导致溶菌酶能够溶解细菌细胞外一些多糖之间的糖苷键，导致细菌细胞缺乏支撑最后涨破。细菌细胞缺乏支撑最后涨破。 3 3、病原菌本身抗性基因、病原菌本身抗性基因 病原菌本身参与寄主识别的基因在寄主相互病原菌本身参与寄主识别的基因在寄主相互作用时其重要，将病原菌的这些基因转入植物中，作用时其重要，将病原菌的这些基因转入植物中，使其表达，从而干扰病原菌的正常生理代谢，导致使其表达，从而干扰病原菌的正常生理代谢，导致植物表现出抗性。植物表现出抗性。(四四)抗

51、病毒改良抗病毒改良 1 1、CPCP基因基因 病毒外壳蛋白病毒外壳蛋白(coat protein,CP)(coat protein,CP)基因是病毒编码外壳蛋白基因是病毒编码外壳蛋白的基因，利用病毒外壳蛋白转基因增强植物抗病毒能力的原的基因，利用病毒外壳蛋白转基因增强植物抗病毒能力的原理是：理是： 病毒的裸露的核酸进入植物细胞后，立即被植物细胞中病毒的裸露的核酸进入植物细胞后，立即被植物细胞中的的CPCP包裹，阻止了翻译和复制。包裹，阻止了翻译和复制。 CPCP抑制病毒脱壳。抑制病毒脱壳。 侵染信号识别，如发现侵染信号识别，如发现CPCP则不侵染，未发现则侵染。则不侵染，未发现则侵染。 2 2

52、、病毒复制酶基因、病毒复制酶基因 病毒复制酶基因在病毒侵入植物后与植物核糖病毒复制酶基因在病毒侵入植物后与植物核糖体结合后转录并表达成病毒复制酶。体结合后转录并表达成病毒复制酶。该基因导入植物后，可诱导植物产生病毒抗性。该基因导入植物后，可诱导植物产生病毒抗性。作用原理不明。作用原理不明。 病毒复制酶介导的抗性远远高于外壳蛋白基因病毒复制酶介导的抗性远远高于外壳蛋白基因介导的的抗性，即使病毒接种量很高，仍然存在抗性介导的的抗性，即使病毒接种量很高，仍然存在抗性。 3 3、病毒卫星、病毒卫星RNA RNA 病毒中在核苷酸序列外有时会出现病毒卫星病毒中在核苷酸序列外有时会出现病毒卫星RNARNA，

53、他们不与核苷酸序列同源，但可以改变病毒，他们不与核苷酸序列同源，但可以改变病毒的致病能力。的致病能力。 优点：灵敏，优点：灵敏， 缺点：不确定性，增强或减弱致病性，来源有限缺点：不确定性，增强或减弱致病性，来源有限，重组风险、释放风险，重组风险、释放风险 4 4、核糖体抑制蛋白基因、核糖体抑制蛋白基因 核糖体失活蛋白核糖体失活蛋白(ribosome inactive protein, (ribosome inactive protein, RIP) RIP) 可以抑制病毒蛋白质生物合成，使病毒不能合可以抑制病毒蛋白质生物合成，使病毒不能合成自身蛋白质。核糖体失活蛋白基因可以使植物获成自身蛋白质

54、。核糖体失活蛋白基因可以使植物获得广谱性病毒抗性。得广谱性病毒抗性。5 5、干扰素基因、干扰素基因干扰素是脊椎动物在受病毒侵染后形成的一种干扰素是脊椎动物在受病毒侵染后形成的一种小分子蛋白质，能结合在细胞膜上形成抗病毒状态小分子蛋白质，能结合在细胞膜上形成抗病毒状态。原理是干扰素可以抑制病毒与细胞膜的结合。原理是干扰素可以抑制病毒与细胞膜的结合。 6 6、缺陷干扰颗粒、缺陷干扰颗粒 缺陷干扰颗粒缺陷干扰颗粒(defective interfering, DI)(defective interfering, DI)是指那是指那些序列与亲本病毒相似但必须依赖亲本病毒才能复制些序列与亲本病毒相似但必

55、须依赖亲本病毒才能复制的的RNARNA分子。它的序列与病毒同源。分子。它的序列与病毒同源。 抗病毒原理：竞争病毒复制酶。抗病毒原理：竞争病毒复制酶。 (五五)抗除草剂改良抗除草剂改良1 1、各类除草剂的作用机理、各类除草剂的作用机理( (作用的靶酶作用的靶酶) )(1)(1)草甘膦草甘膦(glyphosate)(glyphosate)抑制芳香族氨基酸合成的关键酶：莽抑制芳香族氨基酸合成的关键酶：莽草酸羟基乙烯转移酶草酸羟基乙烯转移酶(EPSPS)(EPSPS)活性。活性。(2)(2)磺酰脲磺酰脲(sulfonylurea)(sulfonylurea)抑制支链氨基酸合成的关键酶：乙抑制支链氨基酸

56、合成的关键酶：乙酰乳酸合成酶酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)(acetolactate synthase, ALS)活性。活性。(3)(3)草丁膦草丁膦(phosphinothricin)(phosphinothricin)是有机磷除草剂，抑制植物谷是有机磷除草剂，抑制植物谷胱甘肽合成酶胱甘肽合成酶(Glutamine synthase(Glutamine synthase，GS)GS)(4)(4)三嗪除草剂三嗪除草剂(triazine)(triazine)抑制光合系统抑制光合系统II II的的QbQb蛋白与质体醌蛋白与质体醌的结合，阻断光合作用。的结合，阻

57、断光合作用。(5)(5)溴苯腈溴苯腈(bromoxyril)(bromoxyril)抑制光合作用系统的电子传递链。抑制光合作用系统的电子传递链。 2 2、抗除草剂转基因改良策略、抗除草剂转基因改良策略(1)(1)靶蛋白过量产生：靶蛋白过量产生：机理：产生过量靶蛋白，使抑制作用有限。机理：产生过量靶蛋白，使抑制作用有限。举例：采用超量表达载体转基因表达举例：采用超量表达载体转基因表达EPSPSEPSPS，可以抗草甘磷类除草剂，可以抗草甘磷类除草剂(2)(2)靶蛋白基因突变：靶蛋白基因突变：机理：寻找对除草剂不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白编码基因。机理：寻找对除草剂不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白编

58、码基因。但往往导致植物减产。但往往导致植物减产。举例：除草剂选择法，寻找靶酶举例：除草剂选择法，寻找靶酶EPSPS/ALS/QbEPSPS/ALS/Qb的突变体，进行繁殖的突变体，进行繁殖，或者克隆其中的基因进行转基因育种。，或者克隆其中的基因进行转基因育种。 (3)(3)除草剂降解和解毒基因利用：除草剂降解和解毒基因利用： 乙酰辅酶乙酰辅酶A A转移酶基因转移酶基因- -草丁膦，草丁膦，bar:bar:来源于来源于链霉素的乙酰辅酶链霉素的乙酰辅酶A A转移酶基因转移酶基因水解酶基因及其利用：腈水解酶水解酶基因及其利用：腈水解酶(nitrilase)(nitrilase)超氧化物岐化酶：超氧化

59、物岐化酶：SOD SOD (六六)抗寒性改良抗寒性改良1 1、抗冻蛋白基因、抗冻蛋白基因(1)(1)来源：生物中具有降低冰点和减少冰晶生长速来源：生物中具有降低冰点和减少冰晶生长速度的蛋白质。其中鱼类研究较多。度的蛋白质。其中鱼类研究较多。(2)(2)抗冻机制：抗冻蛋白可以和冰核结合，减少冰抗冻机制：抗冻蛋白可以和冰核结合，减少冰晶生长，降低溶液冰点，从而抑制结冰伤害。晶生长，降低溶液冰点，从而抑制结冰伤害。2 2、渗透调节相关基因、渗透调节相关基因 93转转 基基 因因 甜甜 椒椒转基因辣椒可在冬季生长(以色列) (七七)抗旱、抗涝改良抗旱、抗涝改良1 1、脯氨酸合成酶基因、脯氨酸合成酶基因

60、 (1)(1)大豆大豆(P5CR)(P5CR)、黑麦、黑麦 (2)(2)作用机理：渗透调节作用机理：渗透调节2 2、甜菜碱合成相关酶基因、甜菜碱合成相关酶基因 (1)(1)相关酶：胆碱加单氧酶相关酶：胆碱加单氧酶(CMO)(CMO)、甜菜碱醛脱氢酶、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)(BADH) (2) (2)作用机理：渗透调节作用机理：渗透调节 3 3、渗调蛋白基因、渗调蛋白基因(1)(1)渗调蛋白渗调蛋白(osmotin(osmotin，OSM)OSM)，植物中普遍存在，植物中普遍存在(2)(2)作用机理：渗透调节作用机理：渗透调节4 4、胚胎后期丰富蛋白、胚胎后期丰富蛋白(lateral emb