张扬基因芯片

1、LOGO基因芯片及应用基因芯片及应用 报告人：先进通量(上海)生物技术有限公司张 扬 博士Company 内容简介内容简介v 第一部分第一部分 芯片概述芯片概述v 第二部分第二部分 几种芯片的应用介绍几种芯片的应用介绍v 第三部分第三部分 不同芯片平台的介绍不同芯片平台的介绍v 第四部分第四部分 芯片实验中应该注意的问题芯片实验中应该注意的问题v 第五部分第五部分 定制芯片的一个案例介绍定制芯片的一个案例介绍Company 生物芯片生物芯片研究基因组学的有力工具研究基因组学的有力工具 Protein-DNA interactionsChIP-on chipCompany What whole

2、genome scanning for?v影响表观遗传学的重要因子SNP的变化基因组甲基化基因拷贝数变化插入，缺失v采用的技术Affymetrix SNP系列芯片（SNP, CNVs) Agilent CGH系列芯片IlluminaHap 系列芯片Company SNPSNP与遗传突变与遗传突变vSingle Nucleotide Polymorphisms (SNPs)是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。v在人类基因组中大概每300个碱基就有一个SNP 。v从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2

3、:1。vSNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。v一般而言,大多数SNP对细胞功能无影响，但少数可以使人对疾病易感，或者对药物敏感。Company 为什么为什么SNP会变化？会变化？Company SNPSNP和肺癌和肺癌v4月3日Nature上发表文章公布了肺癌和遗传疾病的关系。v发现肺癌和编号为 rs1051730和rs8034191的SNP位点有关。两个位点都位于15号染色体上，影响到多个基因，其中包括三个尼古丁受体基因。v这两个位点的突变使得吸烟者患肺癌几率增加了80%。Company CNVs - Copy

4、Number Variations (拷贝数变异拷贝数变异)vCNV在人类多样化和进化中非常重要。在人类多样化和进化中非常重要。 CNV区域比SNP包含更多的核苷酸内容。在HapMap人群中已识别1447个 CNV区域，这些区域覆盖了12%的人类基因组（360MB）。vCNV在人类生物学和疾病中非常重要。在人类生物学和疾病中非常重要。 CNV区域包含成百上千的基因、功能要素和分段重复序列。vCNV在遗传研究中非常有价值，可作为在遗传研究中非常有价值，可作为SNP的补充信的补充信息。息。HapMap人群的许多CNV中存在大量的CNV型变异和明显的连锁不平衡。 Company Comparativ

5、e Genomic Hybridization (CGH)BAC1redgreenredgreenBAC2probestargetnormaltumorCompany Company 自闭症自闭症(Autism)(Autism)和染色体和染色体16p11.2.16p11.2.的部分缺失的部分缺失Company Company 采用采用FISH探针验证结果探针验证结果Analysis with Fluorescence in Situ Hybridization (FISH).BAC clone RP11-504I2 was used as a probe for FISH analysis.

6、signal was seen on one chromosome 16 (arrow) but not on the other chromosome 16 (arrowhead). Company Tiling的技术原理的技术原理Exon BExon A35 bp spacingGenome5 bp spacing35 bp5 bp10 bp gap20 bp overlapCompany Tiling array的应用领域的应用领域v Mapping regions of transcription （测定RNA转录区域）v Transcription factor binding si

7、tes（测定转录因子在DNA上的结合区域）v Sites of DNA methylation（DNA 甲基化位点）v Histone Modification（染色体组蛋白修饰） v Chromosomal origins of replication （基因复制起点）v RNA binding protein sites（RNA结合蛋白在RNA上的结合位点）v Chromosome copy numbers and deletions （染色体拷贝数及缺失）v Population biology/Evolution （群体生物遗传及进化）Company Tiling芯片的使用案例芯片的使

8、用案例目的目的:研究拟南芥的表观遗传学和转录多型性。材料：材料：Columbia (Col) and Vancouver (Van)研究方法：研究方法：通过Tiling array研究两者基因组CCGG甲基化位点差异。使用识别CCGG位点HpaII和MspI两种限制性内切酶酶切基因组DNA,其中，HpaII在CCGG内的胞嘧啶被甲基化的情况下无法识别酶切位点，而MspI则可以。推论：推论：如果CCGG有甲基化，则样本被两种限制性内切酶酶切的片段有差异，通过比较片段的差异可知酶切的位点。Company 拟南芥的拟南芥的Tiling array实验结果实验结果Company Tiling and

9、TillingvTILLING,即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(定向诱导基因组局部突变技术),是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikoff领导的研究小组发展起来的,是一种全新的反向遗传学研究方法.TILLING技术借助高通量的检测手段,快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变.Company Company DNA甲基化甲基化DNA methylation occurs at 5MC within CpG dinucleotides. CpG frequency 5X less

10、than expected, though to be due to increased mutation at CpGs. Transitions (C-T) occur at 10-40 fold higher than other dinucleotides. CpGs are not randomly distributed in the genome. CpGs are methylated in repeats and 3 regions of genes, but not in CpG islands. There are estimated to be about 26,000

11、-45,000 CpG islands, many which tend to be located in the promoter regions of housekeeping genes and some tissue specific genes.Company Company Company DNA is compacted into chromatin by complexing with nucleosomes made up of histone octomers. The histone tails extend out from the nucleosome and can

12、 be modified (for example by methylation or acetylation) to etermine the accessibility of DNA for transcriptionCompany 各种芯片平台介绍各种芯片平台介绍vAffymetrix芯片平台vIllumina芯片平台vAgilent芯片平台vCombimatrix芯片平台vBeckman SNP stream平台Company Affymetrix芯片平台芯片平台v技术成熟，稳定度高，拥有完整的质量控制体系，以及Netaffx数据库支持。v是目前探针密度最高的一种芯片，推出时间较早有大

13、量的文章支持。v对实验仪器和实验环境的要求高，试剂，芯片费用较高。v可供选择的芯片种类较多，其中研究外显子的芯片为其所独有。Company 预制的基因芯片预制的基因芯片 芯片滚动杂交仪芯片滚动杂交仪 全自动芯片洗涤工作站全自动芯片洗涤工作站 智能化的分析软件智能化的分析软件高分辨率的芯片扫描仪高分辨率的芯片扫描仪Company GeneChipGeneChip 的操作流程的操作流程以真核生物为例以真核生物为例总总RNA的制备的制备反转录反转录体外体外转录转录生物素标记的生物素标记的cRNA片段化处理片段化处理带标记的带标记的cRNA片断片断35-200 bases0.5-2 ug/ul起始用量

14、起始用量5-10ug（IVT）杂交混合液的制备杂交混合液的制备EukaryoticHyb.ControlControlOligo B2数据分析数据分析Company 光蚀刻原位合成技术光蚀刻原位合成技术Company 2.高密度的点阵技术高密度的点阵技术 Company Affymetrix芯片的探针设计原理芯片的探针设计原理基因序列基因序列1120对对25mer探针探针MismatchPerfect Match MM Mismatch 单点突变单点突变Oligo 探针探针Company 基因表达基因表达开放开放基因表达基因表达关闭关闭多个检测结果可以参考多个检测结果可以参考只有一个点的信号只

15、有一个点的信号PM探针探针MM探针探针Company 13,400Signal Intensities:13,090Signal Intensities:Signal Intensities:13,400Signal Intensities: 11,670Company Company Affymetrix定制芯片定制芯片v采用光蚀刻原位合成v使用现有的Affymetrix仪器和操作体系v获得Affymetrix公司专业的技术支持和探针设计协助v质量控制点设计的比较合理v体系比较成熟，容易掌握v但起定数量要求较多，总项目费用昂贵Company villumina芯片采用结合到玻璃微珠上的预先合

16、成的寡核苷酸作为探针，再将玻璃微珠排列到透明基片上形成芯片。v对于SNP检测，illumina独创了单核苷酸延伸法，提高了检测的准确度。v目前表达谱产品种类还比较少，但价格比较经济，质量上也非常理想。v在SNP检测方面，产品种类丰富，质量可靠，获得广泛的认同。Company Illumina芯片合成示意图芯片合成示意图Company Illumina公司的各种芯片公司的各种芯片Company Illumina Golden Gate定制芯片定制芯片v灵活的SNP定制芯片,基于和illumina芯片相同的原理。v可以提供96，384，768，1536四种不同规格的通量的芯片容量，灵活的满足各种实

17、验要求的需要。v可以合成16，96，384个样本通量的芯片，根据不同的任务要求灵活调整。v总体费用比较低廉，性价比很高。Company 12 Sections(max 288K beadtypes, 144K loci)890,000 featuresper sectionAverage 30 foldredundancy12 Sections(max 288K beadtypes, 144K loci)890,000 featuresper sectionAverage 30 foldredundancyCompany Illumina 芯片原理芯片原理v 基因组基因组DNA经过处理后，用来

18、经过处理后，用来作为扩增的模板。作为扩增的模板。v 带有特异性序列的引物和带有地带有特异性序列的引物和带有地址序列的引物对模板址序列的引物对模板DNA进行进行扩增。扩增。v 具有和具有和SNP位点互补核苷酸的序位点互补核苷酸的序列可以在扩增中延伸，和地址序列可以在扩增中延伸，和地址序列联系到一起。列联系到一起。v 特异性序列末端具有根据不同碱特异性序列末端具有根据不同碱基标记上的不同染料。基标记上的不同染料。v 标记好染料和地址序列的片段和标记好染料和地址序列的片段和结合在玻璃微珠上的地址序列结结合在玻璃微珠上的地址序列结合。对结果进行判断合。对结果进行判断。Company Illumina

19、芯片原理芯片原理Company Agilent Printed MicroarrayCompany eArray系统和定制芯片系统和定制芯片Company Combimatrix芯片芯片Company Company Combimatrix芯片的合成原理芯片的合成原理 1v 在超大规模集成电路的基片上制在超大规模集成电路的基片上制作了数量众多的各自独立受到电作了数量众多的各自独立受到电脑控制的电极。这些电极在电脑脑控制的电极。这些电极在电脑的控制下，可以同时合成数千种的控制下，可以同时合成数千种不同的分子。不同的分子。v 电极上具有生物亲和性的多孔的电极上具有生物亲和性的多孔的空间。便于合成分

20、子的原料进入空间。便于合成分子的原料进入，并有助于合成后的分子牢固地，并有助于合成后的分子牢固地结合于其上。结合于其上。Company Combimatrix芯片的合成原理芯片的合成原理 2v 每个电极上，多孔的反应空间都每个电极上，多孔的反应空间都受到应力场的限制，这种应力场受到应力场的限制，这种应力场使得反应的原料和合成出的分子使得反应的原料和合成出的分子被限制在一个特定的区域内，仿被限制在一个特定的区域内，仿佛存在一个腔壁结构。佛存在一个腔壁结构。v 数以千计的合成在电极上，并牢数以千计的合成在电极上，并牢固的结合在多孔的基质的单链寡固的结合在多孔的基质的单链寡核苷酸分子聚合在一起，就成

21、了核苷酸分子聚合在一起，就成了微阵列芯片。微阵列芯片。Company 非常友好的用户界面非常友好的用户界面Company 基于基于Java平台的芯片设计程序平台的芯片设计程序Company Company Company Combimatrix芯片具有很高的可靠性芯片具有很高的可靠性Log2(array 2: Cy3 intensity)Log2(array 1: Cy3 intensity)Company Beckman SNPstream 基因分型系统Company Beckman SNPstream 原理原理53Tag complement forHybridization captur

22、eSNP siteLabeled terminating NTPTag complement forHybridization captureX 12 or 4835TagSNP primerSNP PrimerCompany SNPstream基因分型系统操作流程Primer design（引物设计） Multiplex PCR（多重PCR）Cleanup（纯化）Single base extension reaction（单碱基延伸）Tag-Array hybridization（杂交）Detection（检测）Automated data analysis（自动化数据分析）Company

23、 Beckman SNPstream 基因分型系统v 384孔的规格，每个孔包含16个或者52个“点”每一个点代表一个SNP位点，包括12个或48个标签，4个对照v A在线引物设计，缩短实验准备周期，提高数据保密性v 通量灵活，可扩展性大v 采用单碱基引物延伸法-SNP检测的金标准v 灵敏度高，DNA用量很少，无论12重或者48重，只需要2ng非常适合有限位点的大规模验证工作。Company v Monoplex Input DNANo. of SNPSSuccess Ratev Taqman ABD5-10 ng 1-2485%v Taqman AOD5-10 ng 1-2495%v Taq

24、man Manual5-10 ng 1-2455%v Taqman PDAR5-10 ng 1-24 75%v MGB Eclipse5-10 ng 1-2490%v SNPlex40 ng 24, 4895%v SNPStream 5-10 ng 12, 4895%v Golden Gate 250 ng 96 - 1536 99%v Infinium750 ng 14K 24K 98%v Whole Genomev Infinium750 ng 100K,300K,550K 98%v GeneChip250 ng (x2) 10K,50K,250K 93% Beckman SNPstrea

25、m和其他系统的比较Company Company 芯片实验中常见的问题芯片实验中常见的问题How to prepare my samples?How to design the experiment？Pooling or not?Which one is better, one dye or two dye?How many replicates?How to analysis database?Company How to prepare the samples?vRNA sample for microarray： RNA without degradation （Electrophore

26、sis） Without enzyme inhibitor Better not cDNA Enough amount（total RNA 10-20ug)vDNA sample for microarray： DNA integrity Without enzyme inhibitor Without other Genomic DNA or PCR product contaminate（except pooling samples）Company RNA质量的经验判断质量的经验判断 Company 实验的设计实验的设计Case 1: Samples: Liver tissue from

27、mice treated by cholesterol modifying drugs.Question 1: Find genes that respond differently between the treatment and the control.Question 2: Find genes that respond similarly across two or more treatments relative to control.T1CT2T3T4x 2x 2x 2x 2Company Case 2: interactionSamples: treated cell line

28、s at 4 time points (30 minutes, 1 hour, 4 hours, 24 hours)Question: Which genes contribute to the enhanced inhibitory effect of OSM when it is combined with EGF? Role of time?ctlOSMEGFOSM & EGF 4 timesCompany Pooling or not?在大多数的情况下，pooling的样本可以用来做为参照或者代表一群有共同特征的样本，从而节省芯片的使用量，尽可能多的获得这个群体的共性。但反过来说，也会

29、丢失样品的个体信息。As left pictures shows, the RNA expression level has been significantly affected by certain factors, using total RNA amount as pooling control will lead to information lose.Company Some results.vPooled variance t-test on “individual” data treated versus controls: chipA 669 p0.001 594/(669,

30、 1948) common to overall analysis 226 p2 221/(226, 356) common to overall analysis chipB 245 p0.001 196(245, 743) common to overall analysis 80 p2 77/(80, 143) common to overall analysisCompany Company One dye or two dyes?vOne dye means one sample per chipvTwo dyes means two samples (control and tar

31、get) could hybrid in one chip at the same time.vObiviously, two dyes method will save chips.vBut is this really true?Company Comparing one dye with two dyesv Comparing with two dyes, one dye method could got stronger signals. v Each microarray data could be divided or merge into certain group freely

32、.HighLowTwo dyesOne dyeCompany 我们为什么重复我们为什么重复?v生物生物最经常的变异来源v样品准备样品准备 方法、试剂和操作者v系统系统芯片、仪器、试剂和操作者Sample 1Sample 2Sample 3Company How many replicates?v For Affymetrix systems with the best analysis (see ), we find 3 to 5 chips per group gives useful information. v If an exploratory study aims to find large (more than two-fold) differences between two conditions, then a design with three samples per condition is usually adequate. If the aim is