猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立

1、猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立Diagnostic methods of porcine postweaning multisystemic wasting syndrome崔尚金 *,李曦 ,符芳,曲连东，童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 疫病诊断与流行病学中心 哈尔滨 150001 ）、，-、.前言猪断乳后多系统衰竭综合征（ PMWS ）是一种由猪圆环病毒 2 型（ porcine circovirus 2， PCV2）引起的新病。猪圆环病毒（PCV）是1974年在猪肾传代细胞系PK-15中发现的一种污染病毒，该病毒不产生细胞病变效应（CPE）,无致病性，命名

2、为 PCV1 ;而后在猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）中分离的猪圆环病毒，有致病性，命名为PCV2 PMWS主要感染1-5月龄猪，发病率为4-30%，致死率为70-80% 。断乳猪和生长猪临床表现为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、黄疸、腹泻和体表淋巴结肿大。多种组织发生广泛的肉芽肿性炎症，肉芽肿性淋巴结炎、间质性肺炎、肝炎、间质性肾炎和胰腺炎。病理组织学变化主要是淋巴细胞组织不同程度的衰竭萎缩，淋巴细胞减少。世界许多养猪国家都发生了本病，我国也有本病流行。 PMWS 严重影响猪的生长发育，但对其发病机理，传染源等问题还不完全清楚，本病没有有效的治疗方法，抗生素对 PMWS 患猪无效。但抗生

3、素的使用和良好的饲养管理，有助于控制二重感染。目前还没有疫苗可供应用。1 范围本标准规定了猪断奶后多系统衰竭综合征（ PMWS ）的诊断方法。本标准适用于猪断奶后多系统衰竭综合征的诊断。2 诊断方法的种类和选用确诊 PMWS 需要三个条件：存在相应的临床症状，特征性病理变化，从病灶中检出PCV2 病原。根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验(IELISA )、免疫组织化学试验(IHC )等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。P

4、CR方法用于检测 PCV病毒的核酸，应用型特异性引物可对PCV1和PCV2定型。IFA、间接ELISA方法主要用于检测 PCV 病毒抗体。 IHC 方法主要用于检测 PCV 病毒抗原，并进行病毒的组织学定位。PMWS 的诊断方法，保证了我国对 PMWS 的诊断与国本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国生猪 外的一致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1-2 种方法即可。3 临床症状和病理变化3.1 临床症状根据以下主要的临床症状可作出初步临床诊断:最常见的、也是确诊 PMWS 所必需的临床症状是衰竭和生长发育不良 , 进行性消瘦；其它症状如精神不振、食欲不佳、被毛粗乱，消化不良、肌肉衰

5、弱无力、腹泻、皮肤苍白、黄疸，还有咳嗽、喷嚏、呼吸困难等呼吸系统症状。体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结 肿大。其它不常见的症状有发热、嗜睡、胃溃疡、中枢神经紊乱、猝死。这些临床症状不会同时在同一头 猪上出现。发病猪场在一段时间内会出现大多数症状。一些临床症状由于继发感染或双重感染而恶化。3.2 病理变化3.2.1 剖检变化GIS和外来病的研究工作.最显著的病变是全身淋巴结，特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管、支气管淋巴结及下颌淋巴结肿 大到 2 5 倍，有时可达 10 倍。在 PMWS 感染猪也观察到正常或萎缩的淋巴结。切面硬度增大，均匀的 苍白色，集合淋巴小结也肿大。发生细菌感染，则淋巴结

6、可见炎症和化脓病变，使病变复杂化。作者简介 ：崔尚金：博士，副研究员，目前主要从事动物疫病诊断、流行病学、地理信息系统 * 通讯作者， E-mail:肺肿胀不崩陷，有散在，大而隆起橡皮状硬块。严重的病例，肺泡出血，部分病例尖叶和心叶萎缩或 固质化。并伴有轻度或中度萎缩， 有的病例脾中度肿大，呈肉变。 半数病例肝脏无明显异常， 其它病猪表现不同程度的虎斑状外观， 肝肿大。感染无直接关系，胃溃疡发生是多原PMWS 猪死亡的原因，也是导肾脏水肿，苍白，被膜下有白色坏死灶，盲肠和结肠粘膜充血或瘀血。 许多 PMWS 感染猪有支气管肺炎和胃溃疡，但胃溃疡和 PCV2 因的。支气管肺炎与细菌感染有关，然而

7、胃内病灶引起内出血，导致部分 致皮肤苍白的原因。3.2.2 组织学变化淋巴结的皮质及副皮质区显著扩张，有单核 /巨噬细胞，组织细胞浸润，有时还散布着大量的多核巨细胞。淋巴细胞减少，淋巴结基质常增生或有嗜酸性细胞浸润。淋巴滤泡有由组织细胞、类上皮细胞、巨噬细胞、多核巨细胞、嗜酸性白细胞、淋巴细胞集聚形成的肉芽肿。其它组织有广泛的淋巴细胞、单核细胞、组织细胞浸润。4 病毒的分离与鉴定4.1 材料准备4.1.1 器材：25cm 2 (T25 )细胞培养瓶、直径15mm 盖玻片、55mm圆形有盖平皿、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(CO2)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径

8、0.2 pm的微孔滤膜、普通光学显微镜。4.1.2 试剂： RPMI1640 营养液、犊牛血清、青霉素( 105ug/mL)与链毒素( 10 5ug/mL )溶液、氯仿、300mM D (+ )氨基葡萄糖、 Hanks 平衡盐溶液。4.1.3 细胞培养物：无 PCV 污染的猪肾传代细胞 PK-15 。4.1.4 样品4.1.4.1 样品的采取和送检： 在发病早期， 无菌采取病猪的血清。对病死猪立即采取肺、 扁桃体、 淋巴结、脾、肾、肝等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放-25 C-30 C冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4 C保存送检。4.1.4.2 样品的处理：若样品经 PC

9、R 检测为 PCV 阳性，按如下方法进行处理。血清可直接使用。肺、淋巴结、 扁桃体、 脾、肾、肝等组织混合， 组织剪碎后研磨成糊状， 加入含有 10 5ug/ml 链霉素， 10 5ug/ml青霉素，两性霉素 B 200ug/ml 的RPMI1640 营养液，制成 10% (W/V )悬液，-20 C反复冻融3次或-70 C冻融1次，2000g离心30min。吸取上清液，转移到新的离心管中，每1ml上清加入50ul氯仿,室温下不断混合 10 min ， 1000g 离心10 min 。怀疑有细菌污染的样品，也可用 0.2pm 微孔滤膜过滤处理。取上清，注意避免吸出氯仿，分装，-70 C保存。4

10、.2 操作方法4.2.1 接种样品：取 2ml上清液加到 18ml PK-15细胞悬液，细胞浓度达到5 X104个/ml，培养液用10% 犊牛血清和 1% 双抗的RPMI1640 。将12ml 病毒细胞混合悬液分装到 2 个 25cm 2( T25 )通气的细胞培养瓶中，每瓶6ml 6ml加入到装有直径15mm 盖玻片的55mm 圆形有盖平皿中，置于37 C 5% CO 2培养箱。4.2.2 细胞处理： 接种后18-24h 长成 50-60% 单层细胞， 倾去培养瓶中培养液， 加入 2-3ml 预热 300mM D (+ )氨基葡萄糖，能覆盖细胞足以，放入37 C培养箱继续作用 30min。去

11、除氨基葡萄糖，以Hanks平衡盐溶液冲洗 2-3 次，加入含有 2% 血清的维持液，放回培养箱。以监控病毒生长。4.2.3 继续培养 48h 后，用间接免疫荧光法对平皿中的玻片培养物进行染色，4.2.4 重复感染：取 1 个 T25 瓶反复冻融 3 次。用胰酶消化另一个T25瓶内细胞，悬于 21ml 生长液，再加入第一瓶中的细胞悬液6ml，取15ml接到一个75cm 2(T75)瓶,6ml接到一个T25 瓶， 6ml 接种到有盖玻片的平皿中。4.2.572-96h 后取平皿中玻片进行免疫荧光染色，观察病毒的生长情况。T25瓶反复冻融 3 次，接种到 T75 瓶内，继续传代。取少量细胞悬液进行P

12、CR 的检测。4.3 结果的判断和解释在第一代培养时，若 IFA 检测为阴性应继续盲传，第三代培养 IFA、 PCR 检测为阳性，则判定为 PCV 病毒分离阳性。5 聚合酶链式反应( PCR )5.1 材料准备5.1.1 器材：微量移液器、吸头、离心机、研磨器PCR 仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温干燥箱等。5.1.2 试剂： Tris 饱和酚、氯仿、 10%SDS 、50ug/ml 蛋白酶K、无水乙醇或异丙醇、3 MpH5.2 醋酸钠、75%乙醇；Taq DNA 聚合酶、dNTP(2.5mmol/I)、10 XBuffer、灭菌去离子水、特异性引物、标准DNA 分子量的 Marker 、上样缓冲

13、液。5.2.1 样品的处理：5.2 病毒 DNA 的提取：取发病猪脾、淋巴结、肝、肾等脏器剪碎加入适量生理盐水研磨制成组织匀浆，反复冻融 3 次， 3000g离心 20min ，吸取上清用于提取DNA 。发病猪的全血和血清可直接进行检测。5.2.2 核酸提取：5.2.2.1 取 500ul组织冻融上清、全血或血清加入25ul 10% SDS, 5ul蛋白酶K，振荡混合数次，置37-56 C水浴锅中2-3小时，其间振荡混合几次。5.2.2.2 酚抽提：每管中加入 200ul 酚，颠倒混合30s,12000rpm 离心 10min 。吸出上层水相，转移到新管。5.2.2.3 酚/氯仿抽提：每管分别

14、加入 100ul 和 100ul 氯仿，颠倒混合 30s,12000rPm 离心 10min 。吸出上层水相，转移到新管，并作好标记。5.2.2.4 氯仿抽提：每管分别加入 200ul 氯仿，颠倒混合30s,12000rPm 离心 10min 。吸出上层水相，转移到新管，并作好标记。5.2.2.5 每管中加入 2.5 倍无水乙醇， 1/10 体积的 3MPH5.2 NaAc （醋酸钠），混合数次，-20 C沉淀2h 或过夜。或每管中加入等体积的异丙醇， 1/10 体积的3M pH 5.2 NaAc （醋酸钠），混合数次，室温下沉淀 20-30min 。5.2.2.613000rPm 离心 10

15、-15min, 倒掉管内液体，在滤纸上吸干，不要求完全干燥。5.2.2.7 每管中加入 100-200ul 70% 的乙醇 ,12000rPm 离心 5min 。倒掉管内液体 ,在滤纸上吸干， 放入37 C温箱烘干。5.2.2.820-40ul 灭菌水溶解沉淀，反复吹打沉淀，促进沉淀溶解。5.2.3 PCR 扩增： PCR 反应液应在冰上配制，配液顺序：灭菌水，10 xbuffer , dNTP，引物，Taq 酶,样品 DNA 。5.2.3.1 50ul 的反应体系：Taq (5U/ul) ：0.4-0.5ul10 xbuffer :5uldNTP(2.5mM) ：4ul引物 1 (10pmo

16、l/ul )：2ul引物 2(10pmol/ul )：2ul灭菌水：up to模板 DNA ：5ul5.2.3.2PCV 病毒特异性引物序列：能扩增 PCV1 和 PCV2 ，扩增片段 938bp 。 P1 ： 5-；PCV2 型特gTCTTCTTCTgCggTAACgCCTCCTTg -3， P2： 5- TAggAggCTTCTACAgCTgggACAg -3异性引物序列：扩增 片段为 490bp。P3 : 5- ATTgTAgTCCTggTCgTATATACTgT -3 , P4 : 5-CTCCCgCACCTTCggA -35.2.3.3PCR 的反应条件：95 C 5 min; 94

17、 C 1min, 52 C 1min, 72 C 1min35个循环；72 C10min.5.2.3.4PCR 电泳：取5ul PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳。5.2.4结果判定与解释：PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，扩增出938bp和490bp的两条带为PCV2阳性。只扩增出 938bp一条带为 PCV1 阳性。同时应设正常 PK-15 细胞 DNA 、水阴性对照，不能扩增出任何条带。 PCV1 阳性 DNA 的阳性对照可扩增 938bp ， PCV2 阳性 DNA 的阳性对照可扩增 938bp 和490bp 的两条带。6 间接免疫荧光试验（ IFA ）6.1 材料准备6.1.

18、1 器材：荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。6.1.2 试剂6.1.2.1 IFA诊断板的制备：见附录。6.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄（FITC）结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。6.1.3 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4 C或-30 C冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS 液作 20 倍稀释。6.2 操作方法6.2.1 取 IFA 诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100此PBS液洗一次,弃去 PBS 液并在吸水纸

19、上轻轻拍干。6.2.2 在编号对应的孔内加入 20 倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2 个及其后感染细胞孔 1个，每孔 100ul ，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置 37 C恒温箱中感作 45min 。6.2.3 弃去板中血清，用 PBS 液洗板 3 次，每孔 100ul ，每次 5min ，最后在吸水纸上轻轻拍干。6.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50ul，在37 C恒温箱中感作 45min。6.3 荧光显微镜检查及判定与解释荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板通常用BGi2，吸收滤板用 OGi或GG9），在5倍10倍目镜下检查。标准阳性

20、血清对照中感染细胞孔（P V+ ）应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔（P V-）不应出现特异性荧光；标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔（N V+）和未感染细胞孔（N V）均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔 （CV-）不应出现特异性荧光。 被检血清样品感染细胞孔 （NV+）出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性；否则，判为阴性。7 间接酶联免疫吸附试验（间接 ELISA）7.1 材料准备7.1.1 器材： 96 孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。7.1.2 试剂7.1.2.1 PCV 病毒抗原和正常细胞对照抗原， 由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流

21、行病学中心提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。7.1.2.2 兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与 流行病学中心提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。7.123PCV病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。7.1.2.4抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制。7.1.3 样品：采集被检猪血液分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C或-30 C冰箱保存或立即

22、送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。123456789101112APPS3S3BPPS3S3CNNS4S4DNNS4S4ES1S1S5S5FS1S1S5S5GS2S2S6S6HS2S2S6S6VCVCVCVCVCVC7.2 操作方法参照图。V-为PCV病毒抗原包被列；C-正常细胞抗原包被列；P-标准阳性血清对照孔;N-标准阴性血清对照孔；S1、S2、S3等一被检血清编号。图间接ELISA诊断板加样示意图7.2.1 包被抗原：取96孔平底微量反应，于奇数列加工作浓度的病毒抗原,偶数列加工浓度的对照抗原,每孔100此（参照图2）,封板，置保湿盒内放 37 C恒温箱中感作

23、60min,再移置4 C冰箱内过夜。7.2.2洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔300山，洗涤3次,每次2min，在吸水纸上轻轻拍干。7.2.3封闭：每孔加入封闭液 100卩L,封板后置保温盒内 37 C恒温箱感作2h。7.2.4洗涤：方法同7.2.27.2.5加血清：反应板按图 2编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100山。封板，置保湿盒内于 37 C恒温箱中感作15min。7.2.6 洗板：方法同 7.2.2。7.2.7加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体100此，封板，放保温盒内置 3

24、7 C恒温箱中感作2h。7.2.8洗板：方法同 7.2.27.2.97.2.10加终止液：每孔添加终止液100此终止反应。7.3光密度（ OD ）值测定与计算加底物：每孔加入新配制的底物溶液100此，封板，在37 C恒温箱中感作30min。7.3.17.3.2OD 值计算OD值测定：在酶标测定仪上用入=490nm 读取反应板各孔溶液的 OD值，记入专用表格。按下式分别计算标准阳性血清、 标准阴性血清和被检血清与 2 个平行抗原孔反应的 OD 值的平均值。 标 准阳性血清（P）与病毒抗原（V）反应的均值 PV （OD 490）按式（1）计算。标准阳性血清（P）与对照抗原（C）反应的均值PC（OD

25、 490）按式（2）计算。标准阴性血清（N ）与病毒抗原（V）V（OD 49o）按式（3）计算。被检血清（S）与病毒抗原（V）反应的均值 S. V（OD 490）按式（4）计算。被检血清（S）与对照抗原（C）反应的均值 S. C（OD 490）按式（5）计算。p -V( OD490) =A1(OD490)+ B1(OD4 90p -V( OD490) =A2(OD490)+ B2(OD4 9 0N -V( OD490) =C1(OD490)+D1(OD4 90)S V(OD4 90)=E1 ( OD4 9 0 ) +E1 ( OD49 0 )S V(OD4 90)=E1 ( OD4 9 0 )

26、 +E1 ( OD49 0 ) S/ P = S V( OD490) - S C( OD490) / /2( 以 S1血清为例） ( 4)/2( 以 S1血清为例） ( 5)P -V( OD 4 9 0)-P - C ( OD4 9 0 ) ( 6 )/237.3.37.4结果的判定与解释按式（6）计算被检血清 OD 值与标准阳性血清 OD 值的比值 S/P。7.4.1有效性判定：PV （OD 490）与NV（OD 490）的比值必须大于或等于1.5时，才可进行结果判定.否则，本次试验无效。7.4.2 判定标准与解释A)S/P比值小于0.4,判定为PCV病毒抗体阴性，记作间接ELISA（ ）.

27、B)S/P比值大于或等于 0.4,小于 1.5,判定为疑似 ,记作间接 ELISA（）.C)S/P比值大于或等于1.5,判定为PCV病毒抗体阳性，记作间接ELISA（+）.间接 ELISA（+） 者表明被检猪血清中含有 PCV 病毒抗体 .8 免疫组织化学试验（ IHC ）8.1 材料准备8.1.1 器材：光学显微镜、湿盒、磁力搅拌器、恒温箱等。8.1.2 试剂8.1.2.1 PCV 病毒抗原和正常细胞对照抗原，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提 供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。8.1.2.2 兔抗猪 IgG 辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由中国农科

28、院哈尔滨兽医研究疫病诊断与流 行病学中心所提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。8.1.2.3 PCV 病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中 心提供。使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。8.1.2.4 PBS 缓冲液（pH7.2 7.4） , 0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH 8.0 ）, 1mol/L 的 TBS 缓冲液（pH 8.0 ）,0.4%胃蛋白酶液，3%甲醇-H2O2溶液，封裱剂。TBS/PBS pH9.09.5。标准兔抗PCV2特异性阳性血清，过氧化酶标记的羊抗兔二抗。抗原修复液：1mM 的 EDTA 缓冲

29、液（ pH8.0 ），它适用于大多数需要抗原热修复的抗体。10% 甲醛溶液中，或立即保存8.1.2.5 样品：无菌采集被检猪组织，组织应新鲜、无污染，采后立即放入 于-20 Co8.2 操作方法8.2.1组织块按常规方法制成石蜡切片。8.2.2石蜡切片经二甲苯瞬间脱蜡即可。切片先后浸入95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇水化;8.2.3 浸入 PBS 洗 3 次各 5 分钟；8.2.4 1-3% H2O2 （80% 甲醇配制）滴加在组织切片上，室温静置 10 分钟；825 PBS洗3次各5分钟。8.2.6 微波修复抗原；将片子放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95C 以上，并

30、持续 10-15分钟，室温 20-30 分钟自然晾凉，使蛋白复性。8.2.7 PBS 洗 3 次各 5 分钟；8.2.8滴加正常山羊血清封闭液 ,室温 20 分钟。甩去多余液体。8.2.9滴加工作浓度的标准阳性血清50卩I，同时设加PBS的对照，室温静置 1小时或者4 C过夜或者37 C 1小时。4 C过夜后需在37 C复温45分钟。8.2.108.2.11PBS 洗 3 次各 5 分钟；PBS洗3次各5分钟；10 ）滴加工作浓度的二抗 4050卩I，室温静置，或 37 C 1小时。8.2.128.2.13PBS 冲洗 5 分钟；蒸馏水冲洗。8.2.14苏木精复染 1-2 分钟，流水冲洗，新配

31、制的DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度。8.2.15干燥后，无水酒精脱水 5min, 二甲苯透明 5min ，加拿大胶封片，镜检。PBS 对照的切片8.3 结果的判定与解释 若为 PCV 阳性，细胞浆内酶标抗体抗原复合物呈黄褐色，背景呈淡黄色或无色。呈淡黄色或无色，无黄褐色。9 综合判定 当在临床上怀疑有 PMWS 感染时， 确诊 PMWS 必须符合以下三个条件： 有相应的临床症状， 特征性病理变化，从病灶中检出 PCV2 抗原或核酸。根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，猪群中普遍存在 PCV2 的抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性。确诊必须依靠实验室方法检测出病毒的抗原或核酸。

32、可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。附录 试剂的配制A1 300mM D （ +）氨基葡萄糖 用于病毒分离用37 C预热蒸馏水溶解氨基葡萄糖，加入适当体积（10 X） Hanks平衡盐溶液，0.22um 孔过滤。A210%SDS 用于核酸的提取100g SDS 加水到1000ml，加热到68 C助溶，浓盐酸调 pH值到7.2。A33mol/l 乙酸钠 （pH 5.2） 用于核酸的提取408.1 g 乙酸钠加水到 1000ml ，用冰乙酸调 pH 到 5.2 ，高压灭菌。A4PBS液（ 0.01mol/L PBS, pH=7.2）用于 IFA氯化钠（ NaCl ）8.5 g；磷酸氢二钠（ Na 2HPO 4.12H 2O ）2.5786 g磷酸二氢钠（ Na H2PO4.2 H 2O）0.4368 g ；去离子水加至1000ml ；保存于4 C备用。A5封裱剂 用于 IFA甘油和 0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（PH9.09.5）等量混合;A6洗涤液（ 0.01mol/L PBS-0.1%吐温-20 , PH=7.4 ）用于间接ELISA,现用现配。磷酸二氢钾（ KH 2PO 4）0.2 g磷酸氢二钠（Na 2HPO4 12H2O）2.89 g氯化钠（ N