杜仲对去势大鼠股骨重、矿物含量、胫骨抗弯力及血清碱性磷酸酶的

1、杜仲对去势大鼠股骨重、矿物含量、胫骨抗弯力及血清碱性磷酸酶的影响                          作者：蔡建平， 张贤， 夏树林， 谢焕松 【摘要】   目的观察中药杜仲对去势大鼠股骨重、矿物含量、胫骨抗弯力及血清ALP的影响。方法80只4月龄雌性SD大鼠随机分成4组：假手术组、模型组(阴性对照组)、阿尔法骨化醇（ALF

2、）组(阳性对照组)和杜仲组(实验组)。除假手术组打开腹腔，暴露卵巢后即缝合外，其他3组均摘除双侧卵巢。手术后饲喂10 d，阳性对照组和实验组分别用ALF软胶囊或盐杜仲冲剂灌胃，1次/d，另外2组正常饲养。3个月后，取各组股骨测定股骨重、矿物含量，取胫骨测定抗弯力，取血清测定碱性磷酸酶(ALP)活性。结果与假手术组比较，模型组的股骨重显著降低(P<0.05)，而阳性对照组和实验组股骨重无明显变化(P>0.05)；实验组股骨矿物含量、ALP活性和胫骨抗弯力显著高于模型组(P<0.05)，阳性对照组ALP活性显著低于模型组(P<0.05)和假手术组(P<0.01)。结论

3、盐杜仲可抑制骨吸收，提高骨的强度，对去势大鼠骨质疏松具有一定的防治作用。 【关键词】   去势大鼠 杜仲 抗弯力 碱性磷酸酶Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Eucommia Bark on wEight of femur, mineral content, anti-bend strength of tibiae and serum ALP in ovariectomized (ovx) rats. Methods80 femal SD rats were divided into 4 groups: sham, negatire

4、, positive, and experimental groups. The rats in each group were ovariectomized except sham operation group. 10 days after operation, intragastric administration was used to rats in positive and experimental groups with Alfacalcidol (ALF) and Eucommia Bark respectively once a day. After 3 months, fe

5、murs were separated and wEIght and mineral content were determined, and anti-bend strength of tibiae and serum alkaline phosphatase (ALP) were measured in each group. ResultsThe weight of femur in experimental group was decreased obviously (P<0.05), and positive and experimental groups had no sig

6、nificant change (P>0.05) as compared with sham group. In experimental group, mineral content，activity of serum ALP and anti-bend strength of tibiae were increased compared to negative group (P<0.05), meanwhile activity of ALP in positive group was lower than negative(P<0.05) and sham groups

7、 (P<0.01). ConclusionEucommia Bark can inhibit bone absorption and elevate the bone strength, and has protetive and therapeutic effects on osteoporosis of ovariectomized rats.Key words：Ovx rat;  Eucommia Bark;  Anti-bend strength;  ALP骨质疏松是一个世界范围的、日趋严重的影响健康的重要问题。因骨质疏松引起的严重后果骨折和巨额的医

8、疗费用受到了社会的高度重视1。十多年来，国内外开展了中医中药及中西医结合防治骨质疏松症的研究，取得了一定的进展，但大多数研究是成方及复方对骨质疏松症的防治作用，单味中药对骨质疏松症（OP）的研究不多。本实验通过观察补肾中药杜仲对去势大鼠骨质疏松部分指标的影响，探讨目前临床防治骨质疏松症最常用中药杜仲对骨质疏松的防治作用。 1  材料 1.1  动物健康4月龄SD雌性大鼠，体重250290 g，由南通大学实验动物中心提供实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2007-0021。1.2  药物阿尔法骨化醇 (Alfacalcidol，ALF)软胶囊(江苏南通华山药业有限

9、公司出品，0.25 g/粒，生产批号：070403)，盐杜仲（江苏江阴天江药业有限公司出品，1 g/包，生产批号：070316）。1.3  试剂与仪器血清碱性磷酸酶(ALP)活力测定试剂盒（南京建成生物工程研究所第一分所）。IMADA（依梦达）DPS-0.5型数显推拉力计（规格：0.1N-500N，日本）；UV1200紫外/可见光分光光度计（上海MAPADA仪器有限公司）；台式离心机（Eppendorf，5418型，德国）。 2  方法 2.1  动物分组SD大鼠随机分成4组，每组20只，即假手术组、模型组(阴性对照组)、阿尔法骨化醇（ALF）组(阳性对照组)和杜

10、仲组(实验组)。2.2  动物手术处理腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，阴性对照、阳性对照和实验组大鼠在无菌环境下打开腹腔，摘除卵巢，腹腔分层缝合，肌注青霉素(2万单位/只)。假手术组大鼠除不摘除卵巢外，手术操作均与其他组相同。2.3  药物灌胃手术大鼠饲喂10 d后，阳性对照和实验组开始进行药物灌胃。阳性对照组行ALF灌胃，按照每3粒（0.25 g/粒）灌10只大鼠的计量，蒸馏水加热融化后灌胃；实验组行盐杜仲灌胃，按照每包（1 g/包）灌10只大鼠的计量，蒸馏水冲溶灌胃，两组大鼠灌胃均1次/d，连续3个月，其他组大鼠正常饲养。2.4  股骨重测定各组大鼠称重，然后取左

11、侧股骨，剔除骨表面软组织，称重。2.5  骨矿物含量测定取各组大鼠股骨，剔除骨表面软组织，于三氯甲烷甲醇=21溶液中脱脂72 h，置Muffer炉中600加热30 min，冷却至200 时取出，置干燥器中冷却至室温，精密称重直至恒重。再次置Muffer炉中700800 下灰化12 h，降温后取出置干燥器中30 min，称重，重复灰化至恒重，记灰分重。2.6  抗弯力测定取各组大鼠胫骨，剔除骨表面软组织，置推拉力计模具上，模具支架间距3 cm，自中点处下压，记录胫骨断裂时压力（N）。2.7  血清碱性磷酸酶(ALP)活力测定取各组大鼠外周血，凝固后10 000 r/

12、min离心分离血清。ALP测定采用试剂盒进行，具体步骤：血清10 l，加入试剂一(缓冲液)100 l，试剂二(基质液)100 l，混匀，37水浴15 min，加入试剂三(显色液)300 l，混匀后520 nm比色，得ALP活性单位值(金氏单位)。2.8  统计采用Excel软件t检验方法分析统计，所有数据均以±s表示，检验水准=0.05。 3  结果 3.1  杜仲对股骨重及矿物含量的影响与假手术组大鼠比较，模型组大鼠的股骨重显著下降（P<0.05），说明骨量丧失较为明显，而阳性对照组大鼠和实验组大鼠的股骨重与假手术组没有显著差别。矿物含量的数据显

13、示模型组大鼠与假手术组无显著区别，而实验组与模型组比较，矿物含量显著上升（P<0.05），而阳性对照组的变化则不显著（见表1及图1）。3.2  杜仲对胫骨抗弯力的影响测定数据表明，杜仲对实验组大鼠胫骨抗弯力具有显著增强作用（P<0.05），这种增强作用甚至超过了假手术组（P<0.05），说明杜仲对骨强度具有显著影响（见表1及图1）。3.3  杜仲对血清ALP的影响测定数据显示，实验组大鼠血清ALP活性明显高于模型组（P<0.05），而阳性对照组则明显低于模型组（P<0.05）和假手术组（P<0.01），模型组与假手术组无显著差别（见表1，

14、图1）。表1  各组大鼠测定值（略）与模型组比较，*P <0.05；与假手术组比较，P<0.05, P<0.01 4  讨论 使用去势大鼠模拟人类中女性卵巢功能降低所引起的骨质疏松症已成为学术界应用最多的动物模型2。利用模型动物，不仅有助于研究OP发生 发展 的分子机理，还有助于进行药物干预和 治疗 的机理探讨3。因此本实验选择了去势大鼠动物模型，以临床上治疗骨质疏松的药物阿尔法骨化醇(ALF)为阳性对照组4，5，观察了杜仲对OP的干预效果。从测定的几项指标来看，杜仲对骨质疏松具有一定的防治作用，但与ALF的作用比较，有几点不同：数据显示，去势大鼠体重明显

15、高于假手术组(P<0.01)，这一点与田茂友等6报道有所不同而与Yin J等3报道相同，说明雌激素变化对体重的影响较大。比较ALF和杜仲，ALF对去势大鼠体重增加的作用有较为明显的抑制作用（P<0.05），但盐杜仲却没有显著影响（P>0.05）。研究发现，去势动物股骨重显著降低，而骨矿物含量没有显著差异，说明去势大鼠的骨量丧失主要为有机物的丧失，丧失的有机物为何种物质有待于进一步分析研究。杜仲对骨矿物含量的提升具有较明显的作用，而ALF却没有。骨生物力学中的抗弯力是一项客观反映骨强度的综合指标，是评价各种抗骨丢失措施的重要指标之一7。大多数学者认为对骨质疏松的干预不但要重视骨

16、量，更应该关注骨的质量，因为骨质疏松最终的后果是因为骨的脆性增加而导致骨折。本文研究发现，假手术组和模型组的抗弯力无差别，ALF对抗弯力的影响也无显著性，而杜仲制剂却能够显著提高骨抗弯力（P<0.05）,这不仅表现在与模型组的比较上，也表现在与假手术组的比较上。由于本文杜仲实验是在去势大鼠组进行的，因此该结果暗示杜仲对非去势大鼠骨强度可能具有更为显著的增强作用，当然这还有待于进一步实验加以证实。大量研究证实，碱性磷酸酶（ALP）由成骨细胞产生, 富含于胞浆中, 部分ALP分泌至血液中使血清ALP 明显增加。ALP是骨重建活跃性和成骨细胞活动性的指征，它既可做为成骨细胞的功能标记物, 又可

17、反映其分化成熟程度8，9。本文实验观察到，ALF明显降低了模型组的血清ALP，而杜仲却显著提高了血清ALP活性。上述4点提示，杜仲对去势大鼠骨质疏松的作用机理与ALF存在着差异。    作为单味中药，杜仲对机体骨代谢的调节作用可能仅仅作用于某些环节，因此对防治骨质疏松症仍有局限性。杜仲发挥作用的有效组分或部位，及对骨代谢调节的分子机制还有待于进一步研究。 【 参考 文献 】   1邱明才.骨质疏松研究的现状与展望J.中华医学杂志，2001, 81(14):833.2Russell TT, Avudaiappan M, Sutada L, et al. J

18、ean DS. Animal models for osteoporosisJ. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders 2001，2:117.3Yin J, Tezuka Y, Kouda K, et al. Antiosteoporotic activity of the water extract of Dioscorea spongiosaJ. Biol. Pharm. Bull. 2004, 27(4):583.4Shiraishi A, Ito M, Hayakawa N, Kubota N, Kubodera N, Ogata E. Calcium supplementation does not reproduce the pharmacological efficacy of Alfacalcidol for the treatment of osteoporosis in ratsJ. Calcif