动物细胞培养常用方法

1、?动物细胞培养常用方法一. 细胞增殖周期（cell Proliferatinal cycle）概念细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要 是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指 细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖 周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着 G-S-GkM的顺序进行，G、S、G三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配

2、。因此，细胞增殖周期=间期（G期+S期+G期）+分裂期（M期）。二. 培养细胞生命期（life span of culture cells）很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。 索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维 细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传3050代，相当于150300个细胞增殖 周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体， 则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十 几代。只有当细胞发生遗传性

3、改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才 可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何， 在细胞生 命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。三. 培养细胞一代生存期初代细胞系.$I20-IIH转代数16细14接-XX f1 r种次恃代间隔5k塩传.Jftw养代0.U60.050,14L4：KHjRb0 20- + 0.(160.2l0.()612.21(0J511IM1 Ito1酚红I1 :(11)2II 门O.I20.02卵,OU0 42KCI0 2niLOOKW SOO KWIrI1n 20 C) 40 IK40o jfl0 4/1十.消化液进

4、行原代培养时常常需要用消化液将组织块消化解离形成单细胞悬液，传代培养时也需要用消化液将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰蛋白酶（Trypsin）溶液和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）溶液，有时也用胶原酶（collagenase） 溶液。（一） 胰蛋白酶溶液胰蛋由酶是从动物胰脏分离的一种水解酶，其主要功能为使细胞间的蛋白质水解和细胞分散。胰蛋白酶的活性可用消化酪蛋白的能力表示，常用的有1: 125 和1: 250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。胰蛋白酶分散细胞的能力 与细胞种类及细胞特性有关，适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、 肝、肾等组织。 对传代培养细胞效果也很好。

5、 但对于纤维性组织和较硬的癌组织 效果差。不同种类的细胞以及不同数量的细胞采用胰蛋白酶消化的时间也不相 同。另外，胰蛋白酶浓度大、作用温度高、时间长时，对细胞分离能力也大，但 超过一定的限度会损伤细胞。 新配置的胰蛋白酶可使细胞分散速度增快。 细胞培 养用胰蛋白酶溶液一般配制成 0.25%0.125%的浓度，配制时要用不含 Ca2+、 Mg2+ 及血清的平衡盐溶液（如前面的D-Hank S）,因为CeT、Mg+是细胞膜的重要组成 成分，它们能促使细胞凝集， 有阻碍消化的作用； 血清会对胰蛋白酶产生抑制作 用。因此，也常用含血清的培养液终止胰蛋白酶的消化作用。 胰酶作用及溶解的 最佳PH是89,

6、配制胰酶溶液应将液体调至 pH 8左右，充分溶解，过滤除菌。 过滤后可以再调至 PH 75，也可不调。（二） EDTA溶 液EDTA是一种化学螯合剂，能整合 CeT和Mg+，溶液毒性小，使用方便，也常 用来解离细胞。它的作用机制是，一些细胞尤其是上皮细胞在生长过程中需 Ca2+ 和Mg，参与细胞的连接，维持组织的完整性，而 EDTA从细胞生存环境中夺取 Cf和Mg+，并与这些离子形成螯合物，从而使细胞分离。因此，对于一些贴壁 特别牢固的细胞，可以用EDTA和胰酶的混合液（1:1）进行消化，提高消化率。注意：使用EDTA处理细胞后，一定要用Hank s液冲洗干净，一是由于残 留的EDTA可损伤线

7、粒体，它与核蛋白中的CeT和Mg*结合，破坏核蛋白结构，且 细胞长期处于无CeT的环境中，K浓度降低，细胞呼吸减弱，从而影响细胞生长。 二是由于EDTA乍用不受血清抑制。另外，胶原酶的消化作用依赖于Cf，因此，EDTA不可与胶原酶联用。十一 . 抗菌素溶液常用的是青链霉素， 俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰氏阳性菌有效， 链霉素丰主要对革兰氏阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污 染。配制时用10mL三蒸水溶解1.0 X 106卩g/瓶的硫酸链霉素，取8mL硫酸链霉 素液溶解8.0 X I05IU/瓶的青霉素粉，即成青、链霉素各 1.0 XlO5IU/mL的母 液。使用时，100

8、mL培养基内加母液0.1mL，这样培养基内青、链霉素的最终浓 度为各 100IU/mL。有时为防止支原体和霉菌污染， 要用到卡那霉素液、 制霉菌素或两性霉素 B。 卡那霉素的配法：将一瓶卡那霉素（5.0 X 104卩g/瓶）溶于5mLHank s液中，即 成1.0 X104卩g/mL母液。使用时每100mL培养基内加0.5mL母液，最终使用浓 度为50卩g/mL。制霉菌素不能溶于水，故只能配成 5000IU/mL悬液。使用时每 100mL培养基内加0.5mL母液，最终使用浓度为 25IU/mL。在实际工作中，选择哪一种抗生素、剂量多少、何时加入等，与污染源、抗 菌素的抗菌范围、 抗菌素的稳定性

9、等有密切关系， 应灵活运用。 需要特别注意的 是，抗菌素液配制对要无菌操作、小量分装、-20 C冻存。十二.细胞计数10000 倍。原代细胞制备时.培养的细胞要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行 细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数是细胞培养中一项基本技术， 是了解培养细胞生长状态以及测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要 手段。细胞计数主要利用血球计数板来完成。 血球计数板的每一大方格长为1mm 宽为1mm高为0.1mm体积为0.1mm,可容纳的溶液是0.1卩L,每ImL溶液中 所含细胞数即是视野中每一大方格数出的细胞数的nn牛U；iP *勺片OA,r,|E卫na -*

10、-母血球计離板41式S（一）准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干；（二）准备细胞悬液：用0.25%夷蛋白酶消化单层细胞或收集悬浮培养细胞， 制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于 104个/mL，若细胞数很少，应将悬液 离心（1000r/min ， 5min），重悬浮于DME培养基中；（三）加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。用微量移液器轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧边沿加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。否则要将计数扳和盖玻片擦干净重新加样。（四）计数：在显微镜下，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细 胞压中线时，只计左

11、侧和上方者，不计右侧和下方者。十三.细胞传代培养（一）细胞在培养过程中随着数量的增长，尤其细胞生长十分旺盛时，代谢产 物堆积，CQ增多，培养基的营养成分枯竭，一方面长满培养空间，另一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止，更换培养基也 不能使细胞继续生长，这种情况下，为使细胞能继续生长，都需要将其分成小的 部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程被称为传代培养。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实 验的必经过程。细胞长满80%90或刚刚全部汇合是细胞传代的理想时期，过早 细胞产量不足，过晚细胞健康状态不佳。（二）将分装好

12、的细胞培养物置37C、5%C0培养箱内培养，必要时可于 23d 后换1次生长液，类上皮细胞在57d后可长成单层细胞，成纤维细胞则以 34d 或 57d 为宜。单层细胞已铺满瓶皿底面时，如继续培养，则易老化，甚至脱落； 感染病毒等可影响特异性细胞病变效应的判断， 因此成片细胞不能当天使用对应 换成维持液（不含或仅含2%以下血清的培养液），以后每隔57d换维持液1次， 一般可维持 13周。（三）这种长成单层的细胞可进行传代培养。细胞传代时，首先弃去培养瓶内旧培养液，加入5mL左右生理盐水，清洗细胞表面，然后向瓶内加入 0.25%胰蛋 白酶（或EDTA胰酶-EDTA等），以能覆满瓶底为限，放置片刻，

13、当发现细胞质回 缩，细胞间隙增大，细胞还未漂起时，立即终止消化，弃去消化液，用玻璃注射 器吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞， 使之从瓶壁脱离形成细胞悬液， 计数板计 数后，将细胞调整到5X 105个/ml左右，并分成等份分装入若干培养瓶中（一般 来说一瓶生长致密的细胞可以传 34瓶），将细胞瓶置于CO培养箱（37 C, 5%C0 中继续培养。观察消化程度也可以用肉眼， 当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时 终止消化。对难于从培养瓶基层分离的细胞系， 可以轻轻敲打， 以加速分离过程。 也可在37 r孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。（四）对于悬浮生长的细胞可采用离心法传代，即 1000r/min 离心，去上清， 沉淀物加入新培养液后再混匀传代。 也可用直接传代法， 即让细胞自然沉降， 上 清弃去 1/22/3 ，吹打成悬液再传代。十四 . 细胞冻存与复苏（一） 冻存：采用液氮超低温保存 （-196 r ） ，冻存前 24h 更换新鲜培养液，使 细胞处于充足的营养环境中。 常规法消化细胞， 制备成细胞悬液后通过计数计算 细胞总量。以1000r/min离心10min弃上清再重复离心一次，尽量除去胰蛋白酶。 加入4C预冷的冻存保护液（90% FBS+10BDMS0）调整细胞密度约3.0 X 10 6个/mL。 每支陈存管中装约1mL后封口，标明日期、品种、细胞名称和培养代数。冻存管 置4C8C使D