细菌内毒素检查验证方案

1、细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06起草人: 审核人: 批准人:批准日期:年 月曰纪律惟风整顿3目录1概述2验证目的及范围3验证小组人员组成及职责4验证依据5验证前准备纪律惟风整顿6验证的实施7偏差处理8验证数据及评估9验证报告及评审1O再验证及周期5紀律惟风整顿#11验证文件及归档12附件1概述细菌内毒素检査法系利用鲨试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检査报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行 制备的注射用水需进行细

2、菌内毒素的检査，本方案将釆用凝胶法进行试验。2验证目的和方法本验证方案适用于注射用水的细菌内毎素的检査，通过对鲨试剂灵敏度复核试验.干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检査方法，并对其有效性进行评 价，确保检测方法的专属性.灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。3验证小组人员组成及职责:3J验证小组由以下部门人员组成：质量部.2G生产部。32验证小组组成及职责列表组成职责QC1. 负责起草验证方案的起草2. 负责本方案的培训3仪器仪表校验确认 4负责验证的实施5. 负责数据的收集和整理6. 负责数据分析7. 负责完成验证报告质量部I.负责验证方案、验证报告的审核与批准 2负责验证现

3、场的监督审査生产部1.负责保障设备、器具的完好2负责动力系统的保障4验证依据中华人民共和国药典20巧版1143细菌内毒素检査法5验证前准备7seitivw 整5J验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件几52确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。53相关文件，确认以下文件皆为现行有效版本。序号相关文件文件编号IQHg型电热恒温鼓风干燥箱操作规程1VI-1OO23SC-1OO-JL32生物安全柜操作和维护保养规程1VI-1O13yiQj-s-issi自动手提式灭菌器使用和维护保 养规程W-1O34DX型电热恒温水浴锅

4、操作规程W-JO45久砧型恒温恒湿箱操作规程6案M电子天平操作及维护保养规程11-1067F畑3C型:计操作及维护保养规程8SHPsC型低温生化培养箱操作及維护保养规程仙099VJ-875SDB型净化操作台的操作及维护保养规程347-11310培养基借理规程W-76&验证的实施6实验材料及用具电子天平6儿2电热干燥箱#&丄3恒温恒湿箱6丄4水银温度计6j5旋涡混合器6丄6鲨试剂（具有国家主管部门的批准文号）6儿7细菌内海素工作标准品（由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品丿&丄&细菌内毒素检査用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.0巧EU/mZ：且对内瑋素试验无干扰作用。6丄0实验

5、用具羽液管.凝集管、三角瓶.试管.试管架.洗耳球、时钟.75%酒精棉、剪刀、砂轮。6.2实验准备6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入洛酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充 分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馅水反复冲洗 三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内, 放置入烤箱。622除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至 25O-C待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少小时。达到规定时间后,关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用;如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装

6、的情况下可在两周内使用，否则须再次干 烤除去可能存在的外源性内毒素。63鲨试剂灵敏度复核试验本试验采用凝胶法，凝胶法系通过鲨试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测的方法。6.3J细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈 上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检査用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封 严，置旋涡混合器上混合25分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶 液，即2入、八05入、0.25入（入为所复核的堂试对的标示灵敏度），每稀释一步 均应在旋涡

7、混合器上混合30秒钟。632待复核堂试剂的准备取规格为oarn支的鲨试剂i8支,轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈 轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入oarnf检 査用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。633加样将己充分溶解的待复核鲨试剂8支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），列2支（管八4支（管）4列每列每支分别加入ojm的2入.X、05X X 和 0.25的内毒素标准溶液；另2支（管）加入査用水，作为阴性对照。634加样结束后，将鲨试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，垂直放入试管架上，连同试管架放入37WC恒

8、温恒湿箱中，试管架保持水平状态，保 温6o2分钟。635观察并记录结果。将试管架从恒温恒湿箱中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转“0观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性, 记录为（十）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一） 保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。636实验结果计算如鼓大浓度2入4管均为阳性，最低浓度0254均为阴性，阴性对照为阴性时 实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲨试剂灵敏度的复核结果（入0 (lX/4)式中兀为反应终点浓度的对数值（&）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶 液中最后一个呈阳性结

9、果的浓度。637结果判断637丄判断标准当入（在0.5入2 X （包括65入和2 X ）时判定该批鲨试剂灵敏度复核合格，可用 于干扰实验和供试品细菌内毒素检査，并以入（标示灵敏度）为该批鲨试剂的灵敏度。6372判断结果：（记录附后）6.4干扰实验641目的是检验本公司自制的注射用水对于蛍试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的 供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲨试剂的最大有效稀释倍数的溶 液。642确定最大有效稀释倍数（GfVQ）注射用水的内毒素限值为6251/加匚鲨试剂的标示灵敏度为0.25 FU/rM则最大有效稀释倍数SD为注射用水本身浓度。公司如下:ZMVD=cZ/X式中：为供

10、试品的细菌内毒素限值C为供试品溶液浓度入为當试剂灵敏度的标示值。643制备内毒素标准对照溶液11取支细菌内毒素标准品，用细菌内素检査用水稀释成4个浓度的标准溶液即2 入、入、05入、0.25X （方法同63M）。644制备含内毒素的供试品溶液再注射用水将643中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2入.入.05入、625入的含内毒素的供试品溶液。取规格为o.nn/支的蛍试剂2枝，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划 痕，75於0精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0J初检査用水溶 解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。645加样：按下列表I方法进行加样D将准备好

11、的賞试剂取其中8支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），洌2支（管）其中的4支4列每列每支分别加入5诙的2.0入、 儿0入、05625入的含内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入ojmf 供试品溶液作为阴性对照。2丿将另外M支（管）蛍试剂放在试管架上，排成5列，每列2支（管）C其中的4列每列每支分别加入OJmZ的含20入.儿0入.05从0.25入的内毒 素的标准内毒素溶液，另一列2支（管）加入査用水作为样品阴性对 照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架 放入37土恒温恒湿箱中，保温6o2分钟后，观察并记录结果。表凝胶法干扰试验溶液的准备编号内毒素浓度/

12、被加入内毒素的溶 液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数无/供试品溶2液32 /供试品溶液供试液溶液1242144o5486254C2金査用水检査用水1222124o5280.252无金査用水2注：励供试品溶液；Z为干扰试验系列；C为鲨试剂标示灵敏度的对照系列；Q为阴性对照。只有当溶液神阴性对照溶液Q的所有平行管都为阴性,并且系列溶液CW结果符 合鲨试剂里面的复核试液要求时，试验方为有效。当系列溶液Z的结果符合鲨试剂里 面的复核试验要求室，认为该供试品溶液物干扰作用。其他情况则认为供试品溶液存 在干扰作用。按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平 均值伍用I用供试品溶

13、液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值% 0（ixy4）X八兀分别为用检査用水和供试品溶液或稀释液制成的内尊素溶液的反应终点浓 度的对数值（）。&.as结果判断当在65入20入（包括05入和2.0入）时，且生在05E2.0E （包括05和2O）时，则认为该供试品溶液不干扰实验，可对此供试品进行细菌内素检査。当E不在05 22O（包括0占童和么。）时，则认为该供试品溶液干扰实验。6.4&2判断结果：（记录附后）6.5供试品的凝胶限度试验检査651在细菌内毒素检査中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对 照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。652凝胶限度溶液的制备：按

14、表行各试验溶液的制备表J凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度娥加入内毒素的溶液平行管数无朋试品溶液232 /供试品溶液2C2 /检査用水22?无金査用水2注：久为供试品溶液；3为供试品阳性对照；C为阳性对照；Q为阴性对照。6521供试品溶液的制备：取公司自制的注射用水，不需进行稀释处理。6522阳性对照溶液的制备用检査用水将内毒素标准品稀释制成2入浓度的内毒素标准溶液（方法同6.3a） 06523供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液将内毒素标准品制成2入浓度的内毒素溶液。（方法同6.4.4 制备含内毒素的供试品溶液）6524阴性对照液用细菌内毒素检査用水653鲨试剂的准备取规格为支的鲨

15、试剂枝，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入OJ皿查用水 溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。6.54加样取8支（管）溶解好的卷试剂，其中2支（2）加入0J7n朕试品溶液作为供试品 管,2支（血加入01加/洪试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管，2支（C劝口入o.nnf 阳性对照溶液作为阳性对照管，2支（Q劝口入o.im0査用水作为阴性对照管。6.S5将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37*CrC恒温恒湿箱中，保温6。2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。656结果判断6.56

16、1判断标准若阴性对照溶液Q的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液Z的平行管均为阳性, 阳性对照溶液曲平行管均为阳性，试验有效。若溶液2的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液M两个平行管 均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液久的两个平行管中的一管为阳性，一管为 阴性，需进行复试。复试时溶液久需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试 品符合规定，否判定供试品不符合规定。6.562判断结果：（记录附后）7偏差处理验证的数据产生的任何偏差，应及时进行偏差调査，按照化验室偏差管理规程 进行处理并如实记录，给出合理的偏差处理措施，并上报验证领导小组，记录备案, 并且根据处理措施进行相应的处

17、理，并对处理的过程、结果进行记录与跟踪。验证小组根据数据分析，做出相应的评定与结论，报请验证委员会批准。158验证数据及评估验证小组对验证检测数据进行评估，并对结果进行评价结果评价:评价人:9验证报告及评审9J验证小组依据本方案实施验证，编写验证报告。92验证小组组织专业人员对验证报告进行评审。93 2久对验证报告给出结论，验证合格发放验证合格证。0再验证及周期lOJ当使用新批号的鲨试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲨试剂灵敏度的复合试验。10,2当當试剂.注射用水生产工艺改变或试验回家发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。n.验证文件归档验证结束，全

18、部验证文件（验证方案.验证报告、验证记录、验证合格证等）归 档质量部。附件验证小组组成及职责12.2验证前确认记录J5.5验证结果评估记录&验证合格证验证前确认记录验证前仪器仪表确认序号名称编号上次校验时间是否在有效期内12345确认人:附：表鲨试剂灵敏度复核记录检验目的检验日期检验依据室温试剂名称生产单位批号灵敏度/效价规格鲨试剂细菌内毒素标准品12/支细菌内毒素检査用水实验操作标准品稀释：仪器名称保温时间（ ）保温温度结果记录：浓度 平行样210.50.25阴性对照223/4/结算.过程：平行样鲨试剂标示灵敏度系列递减呈阳性 的最低稀释倍数反应终点浓度(系列递减的最后一个阳性浓度)反应终点浓度的对数值1234竝试剂灵敏度标不值=0.25测试值入严0 W4)ZX/4入严窃(/4)张试剂灵敏度标示值允许范围0.5 *2灵敏度是否符合要求检验员复核人21干扰试验记录鲨试剂28支平行管内毒素浓度21O.5625阴性对照久：供试品溶液JZb/S:2试品溶液血/宏3/宏4/C: 2