阿霉素中毒大鼠背根神经节神经元及细胞核孔的改变

1、    阿霉素中毒大鼠背根神经节神经元及 细胞核孔的改变        【摘要】目的探讨阿霉素中毒所致神经元坏死过程中胞核、胞质及核孔的变化，是否存在凋亡。方法SD大鼠静脉注射阿霉素8 mg/kg，使其腰背根神经节细胞发生变性。利用光镜、电镜、聚焦激光扫描显微镜、TUNEL染色等方法观察不同时期神经元和核孔的变化，寻找凋亡存在的证据。结果阿霉素应用14 d后，核膜切线位核孔的结构变得模糊不清，数量减少；垂直位核膜隔明显稀疏，甚至消失; 神经核中度变性及胞质明显变性。

2、结论核孔的变性是背根神经节细胞坏死性改变的一个重要部分；变性的过程是细胞的坏死，而不是凋亡。【关键词】阿霉素； 脊神经根；神经元； 细胞坏死； 脱噬作用 Changes in lumbar dorsal root ganglion neurons and nuclear pore of the doxorubicin-intoxicated ratsHAN Manfu*, HE Qiuyue, Ohnishi Akio.* Department of Neurology, Red Cross Hospital, Shenzhen 518035, China【Abstract】Objective

3、To observe the changes of the nucleus,cytoplasm and nuclear pore during doxorubicin (DXR) produced degeneration of neurons in the lumbar dorsal root ganglion (DRG) in rats. MethodsThe changes of the DRG neuron and nuclear pore of Sprague-Dawley rats and the presence of apoptosis were studied by usin

4、g light and electronic microscopy and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick-end labeling method in varying time during 1 to 20 days after intravenous 8 mg/kg of DXR was administered. ResultsObservation revealed the degeneration of the moderate nuclear a

5、nd remarkable cytoplasm. In some neurons, there appeared mostly dark and usually moderate degrees of nuclear degenerative changes, and the nuclear pores were decreased in number and becoming obscured 14 and 20 days after DXR administration. As DXR enters presumably the nucleus is partly removed thro

6、ugh the nuclear pores. However, the diameters of nuclear pores were similar to the DXR-intoxicated and control rats. ConclusionThe changes in nuclear pores of neurons in DXR intoxication are considered to be part of the degenerative or necrotic changes of DRG neuron and there appears no apoptosis.【K

7、ey words】Doxorubicin;  Spinal nerve roots; Neurons; Cell death; Apoptosis核孔复合体（nuclear pore complex, NPC）是一个大的巨分子聚合物，埋于核膜的内外层间，在核质的物资交换中起重要作用1，2。阿霉素是一种抗癌药物，可引起动物腰骶部背根神经节神经元（DRG）的变性，并破坏DNA3-5。 我们观察了阿霉素诱导DRG变性过程中核孔的改变。体外实验已表明，阿霉素可引起多种细胞发生凋亡6，凋亡是否参与背根神经节神经元的变性，也是我们研究的目的。材料和方法一、材料雄性SD大鼠60只, 体重22028

8、0 g。第一部分大鼠40只，第二部分20只（由日本产业医科大学实验动物中心提供）。二、分组和实验方法1第一部分：40只大鼠，分为3个实验组和1个对照组。每组10只动物，戊巴比妥钠腹腔麻醉。实验组，阿霉素8 mg/kg颈静脉给药；对照组给予等量生理盐水。3个实验组分别于注射后的10 d、14 d和20 d经左心室,用0.05 mol/L（pH 7.4）的二甲砷酸盐缓冲液、3%的戊二醛混合液室温下灌流固定。取双侧腰5、6背根神经节,于同一固定液中继续固定3 h。每个神经节垂直于长轴切成4块，水洗、1%的锇酸固定3 h，梯度酒精脱水, Epon812树脂包埋。1.0 m厚的半薄切片，甲苯胺蓝染色，光

9、镜观察。光镜定位，超薄切片，铅、铀双重染色，JEOL 1200EX电镜下观察。在超薄切片的神经元切面中，选择核膜的切线点位和垂直点位，以15 000倍和40 000倍的放大率照像，于最终放大倍数100 000倍的电镜照片上测量核孔的外径。在每个实验组和对照组中，计算出核孔的平均外径,并比较它们之间的不同。2第二部分：20只大鼠，分成4个实验组和1个对照组。每组4只动物，如上所述，阿霉素8 mg/kg颈静脉给药，对照组给予生理盐水。注射后的1、3、7和14 d用4% 的多聚甲醛（ pH 7.4）室温下经左心室灌流固定。取双侧腰5、6背根神经节,并于同一固定液中继续固定48 h。右侧背根神经节石蜡

10、包埋，46 m切片， 原位DNA片段专门标记法（TUNEL) 染色，光镜下观察。左侧的背根神经节利用阿霉素的自发荧光，聚焦激光扫描显微镜（Zeiss,Germany）观察，激发光源波长为488 nm的氩离子激光。定性描述和评价阳性荧光出现的部位。所有观察、记录和测量均在双盲条件下完成。结果一、光镜和电镜的一般观察背根神经节细胞可分为亮细胞、暗细胞和中间细胞，亮细胞体积最大，暗细胞最小。阿霉素注射后14 d，腰部背根神经节神经元在光镜下主要表现为胞质中致密体和各种大小空泡的增加及胞核的偏心和不规则（1、2）。10 d时改变较轻，20 d的改变基本同14 d。电镜的改变同光镜一致。核的异常表现为偏

11、心，边界不规则,染色体局部聚集或消失（3）。胞质的异常包括致密体增加，神经原纤维成团块和空泡（46）。胞质和胞核的异常存在于部分细胞。在大多数这样的细胞中，胞质的变化比胞核明显。胞质异常在亮细胞、中间细胞和暗细胞中出现的机率相似，约为10%，但亮细胞核的异常（15%）要高于中间细胞和暗细胞（5%）。10 d组中上述明显的变化可以在较少的神经元中见到。尽管14和20 d组胞质和胞核改变的出现频率相似，但20 d组的改变程度重于14 d组，有些神经元几乎消失。凋亡的标记，即位于核膜致密的、帽状边聚的染色质，核碎片，凋亡小体等在阿霉素注射后1020 d组的各种细胞中反复仔细观察，却始终未发现。二、电

12、镜下核孔改变核孔主要在暗细胞上观察，因为切线位上切到小神经元核的机率较高。对照组中NPC垂直位切片可见细胞的核膜分为内外两层，外层较厚，并有很多高电子密度物质附着，核孔部分被较高电子密度的NPC所封闭，外层为胞质环，内层为核环，中间为致密板层的核孔隔（7上）；而切线位上表现为环型排列的数个小圆型结构，颜色较深，中间有一白色的亮区（8）。实验组14 d以后，40%以上的核孔结构不清，切线位NPC的胞质环和核环模糊不清，乃至消失；并见两环间暗的核孔隔变薄和变淡（7下）。在14 d及以后组10%以上切线位片中核孔结构部分或全部消失，只留下模糊不清的细暗颗粒样物（9）。上述改变常伴随染色质的聚集和核型

13、不规则及胞质的明显变性。核孔的平均外径在对照组中可以清楚地看到并测量，14 d以后组的核孔有些已破坏，很难辩认，而另一些则相对保持完整。我们用最终放大倍数同为100 000倍的电镜照片,利用千分尺测量核孔外径（nm），每组测量的核为7个，核孔数不少于110个（表1）。结果表明，对照组和各实验组中，核孔的外径没有明显的差别。表1各组电镜下所测核孔的平均外径及所测核孔数分组所测核孔数平均外径±标准差(nm) 对照组 1409.6±0.410 d组 120 9.4±0.414 d组 110 9.5±0.420 d组 140 9.5±0.3注：核孔外径

14、值是在最终放大倍数100 000的照片上测得 三、关于凋亡（apoptosis）1、3、7、14 d 4个实验组和对照组背根神经节的亮细胞、暗细胞和中间细胞中，TUNEL染色没有发现明确的核着染；被膜细胞亦未见明显的阳性染色；在表现为胞质异常并伴有偏心核的背根神经节细胞和正常外观的神经细胞中，TUNEL染色均为阴性(10)。聚焦激光扫描显微镜观察，1 d和3 d组亮细胞、中间细胞、暗细胞和被膜细胞的核显示强阳性阿霉素荧光（11）；1 d组细胞质荧光显示为阴性，而3 d组则表现为中度弥散阳性（12）。7 d组中，变性的和正常形态神经元和被膜细胞质显示非常微弱的弥散荧光，而细胞核未见荧光。 1、3

15、、7 d组中没有观察到有荧光的核碎片；在任何相对应的对照组中均没有发现核的荧光。 讨论阿霉素是一种抗癌药，广泛应用于恶性肿瘤的治疗。但它可以引起周围神经变性，所以在动物实验中也将它作为经典的神经毒物, 以制备周围神经病变的动物模型。阿霉素静脉注射后可以进入周围感觉神经节，并到达节细胞，引起神经元的变性4，5，8。它的作用部位在细胞核内，作用机制可能是与DNA相绞联，而引起其双螺旋结构的破坏8。NPC是阿霉素进出细胞核的通路。虽然NPC的正常结构研究已有很多，证明它是一个非常复杂的亚细胞结构，但各种病理条件下NPC变化的研究却很少。阿霉素所致的神经元变性中，NPC变化的研究目前尚未见报道。在透射

16、电镜切线位，神经元核孔表现为暗环，外径大约为90 nm，埋于核膜膜性部分的细颗粒物中2。NPC由1个内外共轴环和1个中心环组成，内外环是由八角对称排列的8个亚单位构成，而中心环则由8个轮辐构成并突入孔道内。在核孔的中央有1个中央块，认为是起控制大分子和核蛋白颗粒核质间主动运输的作用；而8个周边小通道认为是离子和小分子通过核孔的主要通道1，8。从形态学角度讲，若想观察并研究核孔，切片经过核的位置和方向是很严格的。只有垂直于核面的切片才能看清NPC的内外环结构；而要想清楚地看到核孔的圆形结构，只有切片经过核的切线位才能办到。另外，我们所观察到的大量核孔是属于光镜下的暗细胞和中间细胞的。 本实验中，

17、核孔的异常主要表现在切线位上的部分核孔变得模糊不清，有些呈细颗粒状；垂直位上NPC的胞质环、核环和核孔隔的密度降低，有些近于消失。这种变化发生于14和20 d组，常与核的改变有关，如染色质的轻度聚集或局部消失和核形不规则，并伴明显的胞质变性，各种细胞器不完整。因此我们认为，核孔的变化是细胞核中度变性的表现，常伴随核及胞质明显变性。核孔异常的神经病理意义不清，在其他影响脊髓感觉神经元的病理情况下,如甲基汞等中毒时，核孔的变化情况目前还不清楚，有待研究7，9，10。在体外细胞培养中，阿霉素在多种类型细胞中可以引起凋亡，如背根神经节细胞的体外培养中加入阿霉素可引起典型的凋亡改变7。在本活体实验中，从

18、形态学方面使用电子显微镜观察了120 d实验大鼠背根神经节，未发现有染色质呈致密团块，核质浓染和凋亡小体形成等；TUNEL 法染色也未观察到核被染成棕色，胞核皱缩、裂解等；聚焦激光扫描显微镜的观察中均没有发现凋亡存在的证据。在复习文献的电镜照片中也未发现那些表示凋亡的过程。因此，我们的结论是：由阿霉素诱导的脊髓背根神经节神经元死亡的过程中，凋亡不起作用。1光镜下神经元胞核边界不规则和偏心，胞质中致密体明显增加甲苯胺蓝染色×4002光镜下胞质中空泡明显增加甲苯胺蓝染色×4003电镜下核染色质局部消失双重染色×1 5004偏心核伴有胞质的致密体、线粒体和空泡增加(电镜

19、)双重染色×1 5005电镜下各种大小空泡的增加双重染色×1 5006电镜下块状神经原纤维增加伴偏心核双重染色×1 500714 d实验组(上)，电镜下垂直于核膜切片，胞质环、核环和核孔隔比对照组(下)明显稀疏，甚至消失双重染色×40 0008对照组，核膜切线位，核孔呈暗环状，埋于细颗粒物中，边界清楚，颜色较深，中间有1个亮区，数量较多双重染色×15 0009阿霉素注射后14 d组完整的核孔很少，边界不清，有些近于消失，只留下模糊不清的细颗粒样物双重染色×15 00010光镜下7 d组腰部背根神经节外观正常的神经元胞核及表现为胞质异常

20、伴偏心核的神经元胞核均为TUNEL染色阴性TUNEL染色×18011阿霉素注射后1 d腰背根神经节聚焦激光扫描，未观察到带有荧光的核碎片，神经细胞核和被膜细胞核阿霉素荧光为阳性荧光聚焦激光扫描×20012阿霉素注射后3 d组腰背根神经节聚焦激光扫描，未观察到带有荧光的核碎片，神经细胞核和被膜细胞核阿霉素荧光为阳性。细胞质显示中等强度并弥散的阿霉素荧光荧光聚焦激光扫描×200 作者单位：韩漫夫（518035 深圳红十字会医院神经内科）赫秋月（518035 深圳红十字会医院神经内科）大西晃生（日本产业医科大学神经内科）参考文献1，Jarnik M, Aebi

21、 U. Towards a more complete 3-D struture of the nuclear pore complex. J Struct Biol, 1991,107:291-308.2，Peters A, Palay SL, Webster HD, eds. The fine structure of the nervous system. Neurons and their supporting cells. 3rd ed. New York: Oxford University Press, 1991. 48-64.3，Cho ES. Toxic effects of

22、 adriamycin on the ganglia of the peripherial nervous system: a neuropathological study. J Neuropathol Exp Neurol， 1977,36:907-915.4，Ohnishi A. Perimary sensory neuron in experimental adriamycin intoxication. Neuro Med(Tokyo), 1979, 10:378-385.5，Eddy EL, Nathaniel EJH. An ultrastructructural study of the effects of adriamycin on the dorsal root ganglia of young and adult rats. Exp Neurol, 1982, 77:275-285.6，Skladanowski A， Konopa J. Adriamycin and daunomycin induced programmed cell death (apo