免疫亲和层析法快速纯化猪瘟病毒抗体

1、猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus引起的一种高传染性疾病,死亡率高,严重影响养猪业发展。由于多种因素的影响,猪瘟疫苗质量不稳定,影响了猪瘟防治的效果1。另一方面,猪仔的母源抗体对疫苗免疫具有抑制作用2-3。有研究报道4,通过口服或注射猪瘟抗体能够直接提高猪仔的免疫力,降低猪仔的发病率和死亡率。因此,低成本、快速纯化猪瘟抗体在猪瘟的诊断和防治中具有重要意义。由于抗体制备方法、抗体生产、表达系统的多样性,使得抗体的分离纯化技术复杂多样。沉淀法和亲和层析、离子交换层析等方法均有应用5。本实验基于免疫亲和层析原理,将猪瘟病毒固定于惰性载体上作为配基,从高免疫猪血清

2、中分离纯化猪瘟病毒抗体,旨在建立一种成本低、快速有效纯化猪瘟病毒抗体的方法。1.材料与方法1.1细胞及病毒猪传代肾细胞系PK-15由本课题组保存;猪瘟病毒由广东肇庆益信农业发展有限公司提供。1.2主要试剂HRP标记的兔抗猪lgG和脱脂奶粉购自Sigma 公司;Sepharose-4B和Sephadex G-75购自Amersham 公司;DMEM高糖培养基和胎牛血清等细胞培养试剂均购自广州斯佳生物科技有限公司;猪瘟病毒高免疫猪血清由广东肇庆益信农业发展有限公司提供;其他化学试剂均为分析纯或化学纯,购自广州化学有限公司。1.3猪瘟病毒的培养及纯化将PK-15细胞株复苏,在显微镜下观察细胞的生长情

3、况,当细胞生长增殖至铺满单层后,进行细胞传代。待PK-15细胞长至70%80%融合时,接种猪瘟病毒,37培养1h后,加入维持培养液,继续培养72h后取出,反复冻融3次,4,10000r/min基金项目:暨南大学自然科学基金(109057;640073.作者单位:暨南大学生物工程学系(广州510632.通讯作者:李任强,E-mail:trqli 【实验技术】免疫亲和层析法快速纯化猪瘟病毒抗体封琳王桂珍李阳李任强【摘要】目的应用免疫亲和层析技术快速纯化猪瘟病毒抗体。方法将猪瘟病毒接种于猪传代肾细胞PK-15中培养,收获并纯化猪瘟病毒,将其与环氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶联,制备免疫亲和

4、层析柱,从猪瘟病毒高免疫猪血清中纯化猪瘟病毒抗体,分别应用SDS-PAGE和ELISA进行抗体纯度和活性检测。结果自制免疫亲和层析柱的偶联率为0.36mg抗原/g 载体;纯化的猪瘟病毒抗体纯度高,活性强,抗体回收率占猪血清总蛋白的2.45%。结论已建立了成本低、可快速有效纯化猪瘟病毒抗体的免疫亲和层析法。【关键词】免疫亲和层析;猪瘟病毒;高免疫猪血清【中国图书分类号】S852.65+1R392-33【文献标识码】A【文章编号】1004-5503(201110-1233-03Rapid Purification of Antibody against Classical Swine Fever

5、Virus by Im-munoaffinity ChromatographyFENG Lin,WANG Gui-zhen,LI Yang,LI Ren-qiang(Department of Biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China【Abstract】Objective To purify the antibody against classical swine fever virus by immunoaffinity chromatography.Methods Classical swine fever virus wa

6、s inoculated to subcultured pig kidney PK-15cells and incubated.The harvested virus was purified and coupled with epichlorohydrin-activated Sepharose-4B to prepare immunoaffinity chromatographic column by which the antibody against classical swine fever virus was purified from hyperimmune sera of pi

7、gs and determined for purity and activity by SDS-PAGE and ELISA respectively.Results The coupling rate of prepared immunoaffinity chromatography column was0.36mg antigen/g carrier. The purified antibody against classical swine fever virus showed high purity and activity,of which the recovery rate of

8、2.45%of total serum protein.Conclusion A low-cost,rapid and effective immunoaffinity chromatographic method for purification of antibody a-gainst classical swine fever virus was successfully developed.【Key words】Immunoaffinity chromatography;Classical swine fever virus;Hyperimmune pig serum离心15min,收

9、集上清,加入80%饱和度的硫酸铵,盐析过夜,离心收集沉淀,以0.02mol/L的PBS (pH7.4溶解,对水透析除去盐。将透析液上样于1.5cm×32cm的Sephadex G-75分子排阻层析柱,以0.2ml/min流速的去离子水洗脱,收集波长280nm处有光吸收的第1个洗脱峰,真空冷冻干燥,适度浓缩,获得猪瘟病毒。应用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度6。1.4免疫亲和层析柱的制备1.4.1Sepharose-4B的活化:将适量的Sepharose-4B 于烧结漏斗中抽滤去除液体,称取8g(湿重于漏斗上,分别以100ml1mol/L NaCl和100ml蒸馏水洗涤,抽干后,移至小三角瓶内

10、,加入6.5ml2mol/L NaOH、1.5ml环氧氯丙烷、15ml56%的1,4-二氧六环,于37恒温摇床中振摇活化2h后取出,在烧结漏斗中以蒸馏水和0.2mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH9.5洗涤,抽干。1.4.2猪瘟病毒抗原与活化载体的偶联:将10ml 纯化的猪瘟病毒与活化的Sepharose-4B混合,37振荡24h,测定未结合的病毒抗原量,计算偶联率,以每克Sepharose-4B(湿重结合抗原的毫克数表示。将所得已偶联病毒的载体制备成1.0cm×10cm 的亲和层析柱。1.5猪瘟病毒抗体的纯化分别用Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH9.5、去离子水

11、和NaAc-HAc缓冲液(pH3.4、去离子水洗涤亲和层析柱,用0.02mol/L的PBS(pH7.4平衡。将高免疫猪血清用水4倍稀释,以0.2ml/min流速上样,再用0.02mol/L的PBS(pH7.4平衡,洗脱未被吸附的杂蛋白(穿透峰,A280,继续平衡至穿透峰的A280值降至基线。用含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH3.4进行洗脱,收集洗脱峰。将洗脱峰液、穿透峰液先用去离子水透析后,真空冷冻干燥浓缩,计算抗体提取率,并行12% SDS-PAGE鉴定,采用电泳分析系统对电泳图像进行分析。1.6纯化猪瘟病毒抗体活性的测定采用间接ELISA法。将

12、猪瘟病毒抗原用0.05mol/L 碳酸盐缓冲液按11500稀释,包被酶标板,4过夜;用1.5%脱脂奶粉封闭,37孵育1h;洗涤,将纯化的猪瘟病毒抗体倍比稀释,加入酶标板中,37孵育1h;洗涤,加入HRP标记的兔抗猪IgG(15000稀释,37孵育1h;洗涤,加入显色液(TMB,避光显色15min;以2mol/L H2SO4终止反应,在波长450nm 处测定各孔A值7。2.结果2.1免疫亲和层析柱的偶联率经计算,自制免疫亲和层析柱的偶联率为0.36mg 抗原/g载体。2.2纯化猪瘟病毒抗体的鉴定免疫亲和层析图谱见图1。大峰为流穿峰,小峰为洗脱峰。SDS-PAGE分析可见,洗脱峰液包含4条带,其相

13、对分子质量分别约为75000、55000、25000和24000,见图2。经计算,平均每毫升高免疫猪血清中纯化出猪瘟病毒抗体24.1mg,回收率为猪血清总蛋白的2.45%。图1高免疫猪血清蛋白经Sepharose-4B免疫亲和层析柱的洗脱图谱Fig1.Elution profile of high immune pig serum pro-tein from Sepharose-4B immunoaffinity chromatographic column1:洗脱峰;2:流穿峰;M:低相对分子质量蛋白质marker 图2免疫亲和层析各蛋白样品的SDS-PAGE分析Fig2.SDS-PAGE

14、profile of proteins purified by im-muneaffinity chromatography2.3纯化猪瘟病毒抗体的活性ELISA检测结果显示,随着纯化猪瘟病毒抗体稀释倍数的增加,其相对应的A450值逐渐下降,相关系数R2达0.9848,见图3。表明猪瘟病毒抗体随着M r12M M r75000550002500024000972006640044300290002010014300A28时间(min408012016020012345浓度的增加,与抗原结合的能力也增强,说明纯化的猪瘟病毒抗体活性正常。 图3不同稀释倍数的纯化抗体在波长450nm 处的吸光率Fi

15、g 3.Absorbance at 450nm of purified anti body at various dilution folds3.讨论本实验根据免疫亲和层析原理,将猪瘟病毒固定于惰性Sepharose-4B 载体上作为配基制备免疫亲和层析柱,从高免疫猪血清中分离纯化猪瘟病毒抗体。实验结果显示,所制备的层析柱不仅抗原偶联率高,且纯化猪瘟病毒抗体效果较好。说明作为配基的病毒抗原并未因与载体发生固定反应而失去与抗体的特异性结合能力。在实践中,一些配基由于固定反应会发生化学性质的改变,甚至丧失作为配基的功能。因此,亲和层析分离纯化物质的关键不仅要找到配基,还依赖于配基固定后是否仍具有活

16、性。本文纯化得到的猪瘟病毒抗体占免疫猪血清总蛋白的2.45%,回收率较高。经SDS-PAGE 分析和ELISA 检测,纯化的猪瘟病毒抗体纯度较高且活性正常。免疫球蛋白有4条链,包括两条轻链和两条重链。轻链有约241个氨基酸残基,相对分子质量约为24000;重链有450550个氨基酸残基,相对分子质量约为50000750008。本实验SDS-PAGE 得到的4条带与免疫球蛋白的两条重链和两条轻链相符合,证明经免疫亲和层析已纯化出与猪瘟病毒特异性结合的抗体。本实验制备的免疫亲和层析柱具有可反复利用、一步操作即可完成、回收率高等优点,而且猪瘟病毒高免疫血清来源丰富。综上所述,本实验成功建立了成本低、

17、快速高效、适合实际应用的快速纯化猪瘟病毒抗体的方法。参考文献1韩雪清,刘湘涛,赵启祖.猪瘟病毒及其猪瘟疫苗研究进展J .动物医学进展,2000,21(2:1-7.2王永芬,席磊,边传周,等.猪血清免疫球蛋白对新生仔猪生产性能的影响J .中国农学通报,2008,24(8:36-38.3贾永起,房慧伶,曾芸.替米考星和甲硝唑对猪体液免疫和细胞免疫的影响J .中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集,2008.4滑静,曹永春,万善霞,等.饲喂猪血浆IgG 对仔猪血液生化指标和平均日增重的影响J .2004,21(1:36-37.5孙维敏.抗体纯化中亲和色谱配体的研究进展J

18、.离子交换与吸附,2005,21(3:283-288.6李建武,余瑞元,袁明秀,等.生物化学实验原理和方法M .北京:北京大学出版社,2004:240-242.7Paul K ,Manjula J ,Deepa EP ,et al .Anti-Echis carinatus venomantibodies from chicken egg yolk :isolation ,purification and neu-tralization efficacy J .Toxicon ,2007,50(7:893-900.8周光炎.免疫学原理M .上海:上海科学技术出版社,2007:52.(收稿日期:2010-12-14123456A 450稀释倍数3.0002.5002.0001.5001.0000.5000.000【消息】征稿中国生物制品学杂志为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内