大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

1、作者：南清振，高蕾，张振书，杨希山，肖冰，姜泊 【摘要】目的 构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库，筛选人CEA单克隆抗体，并进行序列分析。方法 分离大肠癌患者外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段，克隆于pComb3载体，再经电穿孔转化大肠杆菌XL1Blue菌株，形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库，ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果 逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的、和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化，成功地构建了人源性Fab抗体基因库，库容量达2.1107，Fab基因重组率

2、为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮，出现特异性富集，阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论 成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库，从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体，由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。 【关键词】大肠肿瘤；噬菌体抗体库；Fab抗体；癌胚抗原Abstract： ObjectiveTo construct the Fab phage display antibody library of colorectal cancer

3、so as to screen carcinoembryonic antigen (CEA) phage antibody from the constructed phage display library.MethodsThe total cell RNA was extracted from a colorectal cancer patients peripheral lymphocytes, and reversetranscribed into cDNA. These cDNA were amplified to the light and the heavy chain DNA

4、by PCR using relevant primers, and then cloned into the expression pComb3 vector. Through transformed into XL1Blue Escherichia coli by electroporation, the phage display antibody library was constructed successively. After that, CEA antigen was coated to pan the constructed library in order to selec

5、t antigen binders, and the selected phage antibodies were assayed by ELISA analysis. One positive clone was analyzed by DNA sequenced. ResultsThe amplified fragments of , and Fd DNA were about 680bp. The amplification products were cloned into the expression pComb3 vector and were expressed in XL1Bl

6、ue Escherichia coli. A human Fab antibody library was constructed with a size of 2.1107 and an efficacy of about 50% (, and Fd DNA were all inserted). Using coated CEA antigen to pan the phage display antibody library four rounds, the phage antibodies showed enrichment specifically. The positive clo

7、nes had good antiCEA specificity which verified by ELISA directly and crossreaction. Through DNA sequencing of one positive clone, it showed that its heavy chain belonged to IgG subvariety and its light chain to IgL subvariety. ConclusionWe succeed in constructing a Fab phage display antibodies libr

8、ary with natural immunity by a colorectal cancer patient. From it, we also succeed in obtaining the antibody which has the binding activity to CEA antigen.Keywords： colorectal cancer; phage antibody library; Fab antibody; carcinoembryonic antigen噬菌体抗体库技术将抗体轻链基因和重链基因在体外重组并借助噬菌体表面展示 （phage display）系统对

9、目的抗体基因进行筛选1。 该技术能够绕开细胞杂交瘤技术， 直接从基因水平制备特异性单链抗体，由此开创了简便、快速生产基因工程抗体的先河，这被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命。自该技术的问世，已被广泛用于生物医学的许多领域。 我们采用噬菌体显示技术构建了人大肠癌自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库，以人CEA作为目标抗原，制备了人源性的抗CEA单克隆抗体。1材料和方法1.1材料1.1.1噬粒、菌株、细胞及主要试剂表达噬粒载体pComb3、大肠埃希菌菌株XL1Blue和辅助噬菌体VCSM 13为本研究室保存。淋巴细胞分离液(天津血液研究所) ，总RNA提取试剂盒(invitrogen产品)

10、， 逆转录试剂盒(Promega公司)、Taq酶及PCR缓冲液(TaKaRa公司产品)，DNA凝胶纯化回收试剂盒(TaKaRa公司产品)，各种限制性内切酶（Promega产品）。羊抗人IgG（Fab）HRP购自Pierce公司，邻苯二胺（OPD）购自博士德公司。LB、SB、SOC培养基配置参照文献1。1.1.2PCR引物引物设计参见文献2。由上海生物工程有限公司合成。序列如下：Human variable and constant region PCR primers used for phage library constructionHuman chain variable region

11、5primers：VH1a 5CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GG3VH1f 5CAG GTG CAG CTG CTC GAGTCT GGG3VH2f 5CAG GTG CAG CTA CTC GAGTCG GG3VH3a 5GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG3VH3f 5GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG3VH4f 5CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG3VH4gs 5CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GGC3VH6a 5CAG GTA CAG CTC GAG CAG

12、 TCA GG3VH6f 5CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GGT CCA3Heavy chain1 constant region 3 primer：CGlz 5GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG3 light chain variable region 5 primes:VK1a 5GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA3VK1s 5GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC3VK2a 5GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA3VK3a 5GAA ATT G

13、AG CTC ACG CAG TCT CCA3VK3b 5GAA ATT GAG CTC ACA CAG TCT CCA3 light chain constant region 3 prime：CK1d 5GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT GA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G3 light chain variable region 5 primers：VL1 5AAT TTT GAG CTCACT CAG CCC CAC3VL2 5TCT GCC GAG CTCCAG CCT GCC TCC GTG3VL3

14、5TCT GTG GAG CTCCAG CCG CCC TCA GTG3VL3 5TCC TAT GAG CTCACT CAG CCA CCC3VL4 5TCT GAA GAG CTCCAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG3VL5 5CAG TCT GAG CTCACG CAG CCG CCC3VL6 5CAG ACT GAG CTCACT CAG GAG CCC3VL7 5CAG GTT GAG CTCACT CAA CCG CCC3VL8 5CAG GCT GAG CTCACT CAG CCG TCT TCC3VL9 5CAG TAT GAG CTCACT CAG CCT

15、CCC3VL1b/s 5CAG TCT GAG CTC ACT CAG CCA CC3 light chain constant region 3 primers：CL2 5CG CCG TCT AGA ATT ATG AAC ATT CTG TAG G3Underline nucleotides represent primerencoded restriction sits.CTC GAG 内切酶Xho I识别位点； ACT AGT 内切酶Spe I识别位点 ；GAG CTC 内切酶Sac I识别位点； TCT AGA 内切酶Xba I识别位点。1.2方法1.2.1标本制备、总RNA提取和

16、cDNA的合成抽取大肠癌患者的外周血20 ml，用淋巴细胞分离液常规分离PBMC，然后按试剂盒说明进行总RNA的提取，检测其完整性和纯度。1.2.2逆转录PCR反应采用逆转录试剂盒。反应体积为25 l，取淋巴细胞总RNA 4 g，加入0.5 g Oligo(dt)，40 U RNA酶抑制剂，250 mol/L dNTPs，40 U AMV逆转录酶。于42 60 min，95 5min，合成单链cDNA。然后进行PCR反应，反应体积各为100 l。取上述合成的单链cDNA 2 l 分别加入与、轻链和重链Fd段分别配对的引物各50 pmol/L，dNTPs 200 mol/L，10Taq酶缓冲液1

17、0 l，Taq酶5 U。循环参数为93 45 s， 52 60 s，72 90 s，共35个循环。PCR产物各行1%琼脂糖凝胶电泳分离后纯化回收。1.2.3轻链表达载体的构建纯化的、轻链PCR产物与pComb3分别以适量Xba I及Sac I双酶切后仍经1%琼脂糖凝胶电泳分离后纯化回收。回收的PCR产物等量混均后与线性pComb3连接，连接反应体系中线性pComb3与轻链PCR产物的mol比为1：3，T4 DNA连接酶9 U，总体积50 l，16 反应15 h。连接反应产物以Promega DNA纯化试剂盒纯化。电穿孔(25 kv，200，25 F)转化大肠杆菌XL1 Blue后置5ml SO

18、C培养液中。37 下振荡培养(250 rpm)1 h，加入预温的SB 10 ml(含20 ml/L Amp和10 mg/L Tet)，混匀后即取出10、1、0.1 l 铺在LB平板(含50 mg/L Amp及10 mg/L Tet)上，37 过夜，测定转化率。余继续振荡培养1 h 后调Amp浓度至50 mg/L，再振荡培养1 h，并入100 ml SB(含50 mg/L Amp、10 mg/L Tet)，37 振荡培养(250 rpm)。从过夜培育的细菌中提取质粒，即得带轻链插段的pComb3， 即轻链表达载体。1.2.4抗体Fab段表达载体的构建（噬菌体抗体呈现库的构建）及酶切鉴定将PCR扩

19、增的重链Fd段基因和轻链重组质粒分别以XhoI/SpeI双酶切，按前法进行连接、转化、细菌扩增及转化子测定。但在加入100 ml SB振荡3 h 后， 加入1012pfu的辅助噬菌体VCSM 13，再培养2 h 后，加卡那霉素至70 mg/L， 37 振荡过夜。次晨4 ，4 000g离心15 min，向上清中加入固体聚乙二醇(PEG8000)及NaCl，两者终浓度分别为40和30 g/L，溶解后冰浴30 min， 4 ，9 000g离心20min弃上清，以2 ml 10 g/L 牛血清白蛋白Tris缓冲液(BSA TBS)悬浮噬菌体沉淀， 14 000g离心5 min 以除去残留细菌碎片。上清

20、加叠氮钠(NaN3)至0.2 g/L，即得Fab噬菌体呈现原始库。随机挑取10个单菌落，扩增后提取质粒，分别用XhoI/SpeI及Sac I/Xba I进行双酶切，鉴定其重组率。1.2.5噬菌体抗体的筛选（参照文献3）将CEA抗原用0.05 mol/L 的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至50 mg/L，按每孔100 l 包被酶联板，4 过夜；然后用3%BSA封闭，37 反应1 h 。加入100 l 噬菌体抗体库(约1012 cfu)，37 反应2 h。用TBST（50 mmol/LTrisHCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.5%Tween20）洗涤10次，用蒸馏水冲洗1

21、 min。加入100 l洗脱液(0.1 mol/L HCl，用甘氨酸调pH值至2.2，加入BSA至0.1%)，吹打后室温静置10 min。加入6 l 2 mol/L 的Tris中和。然后将其转入2 ml 新鲜培养的XL1 Blue(A6001)室温静置15 min，取出10、1、0.1 l 铺在LB平板(含50 mg/L Amp及10 mg/L Tet)上，37 过夜，测定转化率。余全部转入10 ml SB培养基(含20 ml/L Amp和10 mg/L Tet)中，37 培养1 h。然后转入100 ml SB培养基(含50 ml/L Amp和10 mg/L Tet)中继续培养2 h，再加入100 l 的辅助噬菌体VCSM13(约1012pfu)，37 培养2 h。加入卡那霉素至70 mg/L，37 振荡培养过夜。次晨4 ，4 000g离心15 min，收集上清，加入聚乙二醇(PEG8000) 和NaCl分别至4%和3%，溶解后冰浴30