电驱动与阳离子交换膜在脱氧核糖核酸捕获浓缩中的应用

1、电驱动与阳离子交换膜在脱氧核糖核酸捕获浓缩中的应用         11-04-22 15:09:00     编辑：studa20              作者：黄华斌 庄峙厦* 张文华 胡佳 杨朝勇 王小如【摘要】  基于电驱动特性与离子交换膜的选择透过性，构建了新型、无损伤的脱氧核糖核酸（DNA）捕获浓缩装置。以-DNA为模型化合

2、物，探究其在自组装装置中的富集特性，优化了实验条件，对浓缩液进行凝胶电泳实验以考察DNA是否变性，并进行聚合酶链反应，以证明本方法回收的DNA可供进一步的生物分析。结果表明：本装置在低电压条件下能够无损伤地捕获DNA，浓缩液可用于进一步的生物分析，DNA的富集倍数达62倍，回收率达46%。本方法操作简便，避免使用大量有机试剂，微型化可与生物芯片联用，在DNA萃取、纯化与浓缩领域有较大的应用空间。 【关键词】  脱氧核糖核酸捕获；电驱动；离子交换膜；浓缩        Abstract  Base

3、d on the selective permeability of cationic exchange membrane and the characteristic of electrical driven，a new and non-damage apparatus that can be used to separate compounds with different electric property was built to capture and enrich DNA.-DNA，as a model compound，was used to study the characte

4、ristic of capturing and enriching DNA in this device.Factors that might affect the efficiency such as voltage and flow speed were optimized and gel electrophoresis was done to study if DNA was denaturation，PCR was done to prove the concentration can be used to further bioanalysis.Results were got：th

5、e apparatus could used to capture and enrich DNA scathelessly under the condition of low-voltage，the concentrate multiple was 62，and the recovery efficiency was accessible to 47%，concentration can be used for the next bioanalysis.Automatic，easy to handle and little organic reagent using made it be a

6、dvantageous，it could be miniatured to combine with other biochips.This method had a large application space in field of DNA extraction，purification and concentration.Keywords  Deoxyribonucleic acid capture；Electrical driven；Ion-exchange membrane；Concentration1  引言核酸的提取和纯化在生物样品的基因分析实验中至关重要。

7、传统的提取方法有酚-氯仿法，该方法设备要求较低，但有机溶剂毒性强，耗时且难以自动化。其它的诸如超声波法1，盐热法2，介电电泳法3等方法也由于各自的缺陷使其应用受到限制。近年来，利用脱氧核糖核酸（DNA）与二氧化硅微球的氢键作用吸附提取DNA的技术成为研究热点4，该方法克服了传统方法溶剂毒性、耗时、难以自动化的缺点，但微球的制备、灌注与芯片封装等步骤的工艺技术要求较高47。目前，膜分离技术越来越受重视，应用超滤和纳滤膜的筛选特性对不同分子量的生物样品进行分离的方法有很多报道8，而离子交换膜的应用主要在脱盐工业上，利用其截留特性进行生物样品尤其是生物大分子分离的应用报道较少。本实验结合电场的定向驱

8、动特性和阳离子交换膜对负电性物质的截留，构建了一个无损伤的DNA捕获浓缩装置，考察了其富集特性，并优化了实验条件。此方法在生物样品的分离纯化方面有较大的应用空间。2  实验部分2.1  仪器和试剂HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；稳压直流电源(上海力友电气公司)；PowerPac Basic凝胶电泳仪（BIO-RAD公司）；ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计(Thermo公司)；凝胶成像系统（Kadak公司）；PCR仪（BIO-RAD公司）；铂金电极，阳离子交换膜（Nafion1135，DuPont）。-DNA（0.3 mg DNA/mL，MBI）； Taq

9、 DNA 聚合酶（Promega）； 琼脂糖（LP0028A，英国Oxoid公司）； 脱氧核糖核酸（dNTP，Promega公司）； 溴化乙锭（Sangon生物公司），其它试剂均为分析纯。超纯水由Milli-Q制得（R=18.2 M）。阴极缓冲液：TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.0)； 阳极缓冲液(1 mmol/L KH2PO4+3.5 mmol/L K2HPO4+1 mmol/L Na2SO4，pH 9.0)。-DNA扩增片段包括101 bp，正引物5-TAA GCA CGA ACT CAG CCA GAA CGA-3，反引物5

10、-CAA GCT TTG CCA CAC CAC GGT ATT-3（Promega公司）。2.2  装置与原理本简易装置综合利用流路死体积，电驱动特点和离子交换膜的截留特性。如图1，装置主要部件由玻璃拉制而成，膜借助卡套固定，恒流泵所用管路和接口为硅胶管，其它管路为聚四氟乙烯管，两电极之间的距离约5 cm。DNA缓冲体系借助恒流泵从1处流入，流经捕获界面（支管口）时，负电性的DNA分子在电场中向阳极方向迁移而进入竖直支管，到达阳离子交换膜时由于膜的截留特性，DNA在膜附近堆积并避免了阳极的氧化作用。  图1  DNA捕获浓缩装置示意图（略）Fig.1 

11、 General sketch of device used to capture DNA实验时，打开止水夹，向其中注入缓冲液，使膜上区域充满阴极缓冲液至支管口，确保支管中无气泡，关闭止水夹。注入阳极缓冲液并充满阳极区域，液面高于膜以确保膜附近无气泡。打开恒流泵，待液体流至阴极，开启稳压电源。待溶液全部流过支管口，关闭稳压电源，打开止水夹，收集浓缩液150 L。实验结束用阴极缓冲液清洗管路。由于通电时间的延长，阳极缓冲溶液中阳离子浓度降低，需及时更新。实验中，当pH8.0时更换。膜使用前用阳极缓冲液浸泡。2.3  实验方法为证明浓缩液可用于进一步的分析，对浓缩液进行PCR实验。模板分

12、别为空白（TE）、19.0 g/L标准-DNA和250 V条件下收集的浓缩液进行PCR实验。热循环参数为：94 预变性3 min；然后以94 变性 30 s，56 退火30 s，72 延伸30 s，扩增20个循环；最后72 延伸5 min使反应完全。反应完成后，取反应产物10 L在3.0%琼脂糖凝胶上进行电泳（1×TAE电泳缓冲液，电压70 V， 40 min），凝胶成像系统拍摄电泳图谱。25 L PCR 反应体系中含有正反引物各0.01 mol， dNTP 5 mol， 2.5 L缓冲液(10×)， 0.25 L Taq DNA 聚合酶及3.0 L模板。3  结果与讨论3.1  DNA溶液浓缩结果浓缩前的稀释液浓度为0.3 g/L，低于Nanodrop的检出限（2 g/L）， 而浓缩液在