霉酚酸酯及地塞米松对血管内皮细胞功能的影响

1、    霉酚酸酯及地塞米松对血管内皮细胞 功能的影响        摘要目的：研究霉酚酸酯，地塞米松对血管内皮细胞功能的影响，进一步探讨这两种免疫抑制剂抗炎作用的机制。方法：以脐静脉来源的内皮细胞为研究对象，通过建立体外内皮细胞血管发生（angiogenesis）模型，观察并比较了两种免疫抑制剂对内皮细胞血管发生，内皮细胞迁移能力（Scratchwoundclosureassay）和内皮细胞增生（3H-TdR掺入）的影响。结果：霉酚酸酯对血管内皮细胞体外血管发生有着

2、较强的抑制作用，而地塞米松的抑制作用相对较弱。此外，霉酚酸酯还能显著抑制血管内皮细胞增生和迁移能力，而地塞米松则对此无显著作用。结论：在对血管内皮细胞功能的影响上，霉酚酸酯具有比地塞米松更为广泛和显著的抑制效应，这可能是霉酚酸酯对一些激素治疗无效的血管炎患者仍有良好疗效的分子机制之一。关键词血管内皮细胞血管发生霉酚酸酯 INFLUENCE OF MYCOPHENOLATE MOFETIL AND DEXAMETHASONE ON THE FUNCTION OF ENDOTHELIAL CELLSLIU HaoLIU ZhihongHUANG Haidong CHEN ZhaohongLI Yi

3、ngjian LI Leishi（Research Institute of Nephrology， Jinling Hospital， Nanjing University School of Medicine， Nanjing 210002）OBJECTIVE To explore the effect of mycophenolate mofetil（MMF） and dexamethasone（DEX） on endothelial cells METHODOLOGY A cell line of human umbilical vein endothelial cells （HUVE

4、C） from ATCC was used in the study In vitro angiogenesis assay model was established to verify the effect of MMF and DEX on the angiogenic activity in HUVEC The migration ability of HUVEC was measured by the scratch wound closure assay and the cell proliferation was determined by 3H-TdR incorporatio

5、n assay RESULTS MMF and DEX were found to inhibit angiogenesis of HUVEC in vitro， and this effect was more potent in MMF The migration and proliferation ability of HUVEC was inhibited significantly by MMF， but not DEX CONCLUSION As an immunosuppressant， MMF is not only effect on the lymphocytes， but

6、 also inhibit the angiogenesis， cell migration and proliferation of endothelial cells These effects of MMF are quite different from dexamethasonKey words vascular endothelial cells angiogenesis mycophenolate mofetil霉酚酸酯（mycophenolatemofetil，MMF）以其独特的免疫抑制效应，在抗移植物排斥反应中的作用已得到了充分的肯定。在临床实践中我们发现，MMF对一些激素和

7、环磷酰胺治疗无效的弥漫增生型（型）难治性狼疮性肾炎有显著的疗效，其中以伴肾组织血管炎病变者效果尤为显著1，2。MMF除了选择性地抑制淋巴细胞增生外，还具有抑制粘附分子产生，抑制血管平滑肌细胞增生的作用3，4。MMF是否对血管内皮细胞有直接的作用？其作用形式如何？目前国内外尚无完整资料可考。本项研究以血管内皮细胞为靶细胞，通过建立体外内皮细胞血管发生（angiogenesis）模型，分别观察了MMF对内皮细胞血管发生，内皮细胞迁移以及内皮细胞增生能力的影响，并与地塞米松进行了比较，以期进一步阐明MMF治疗作用的机制，为指导MMF的临床合理应用提供依据。1材料与方法11药品与试剂MMF在体内需转化

8、成具有活力的霉酚酸发挥其作用，因此，在实验中我们选用了霉酚酸进行观察。地塞米松，霉酚酸及碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF），血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），纤维连接蛋白（fibronectin，FN）均购自Sigma公司。12细胞培养人脐静脉来源的内皮细胞系（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）购自美国ATCC。HUVEC在含10胎牛血清（FCS）的F12培养基中培养。13内皮细胞血管发生体外模型的建立利用低浓度血清和血管发生因

9、子，建立体外血管发生模型。将HUVEC接种于FN预先包被的六孔板上，在含10FCS的F12培养基中生长至近融合状态。将培养基换为含1FCS的F12继续培养12h后，每孔加入bFGF10gL和VEGF15gL诱导血管发生57。根据实验设计加入不同浓度的地塞米松（1 molL，10 molL）及霉酚酸（10molL，50molL）共同孵育，每隔两天用上述培养基换液一次。相位差显微镜下每孔随机选取5个视野，每12h观察一次，记录特定视野下细胞形成芽生状管状结构数目以及管状样结构的长度，连续观察120 h。14内皮细胞迁移能力测定采用划伤愈复测定（scratchwoundclosureassay）对内

10、皮细胞迁移能力进行检测。HUVEC种于六孔板上，生长至融合状态后以不含FCS的F12培养基静止12h，以无菌刮铲划痕，造成细胞间的刮沟。用PBS冲洗两次，加入不同浓度的霉酚酸及地塞米松，每孔随机取三点标记并于显微镜下观察划痕宽度的变化，每24h重复观察一次，连续观察2天8。15内皮细胞增生能力测定采用3H-TdR掺入法测定HUVEC增生能力。正常培养下的HUVEC以胰酶-EDTA消化，用F1210FCS终止后调细胞浓度为3×107L，按100l孔接种于96孔板上，继续以F1210FCS培养24h，随后以无血清F12培养液静止细胞24h，再分别加入不同浓度的地塞米松及霉酚酸在F1210

11、FCS培养液中继续孵育24h，最后12h各孔均加入1Ci3H-TdR。处理完毕以胰酶-EDTA消化各组HUVEC，收集于玻璃滤纸上，干燥后加入闪烁液在液闪仪上记取其DPM值。16统计学方法组间差异采用t检验，P值0.05为差异显著。2结果21VEGF，bFGF可以在合适的培养条件下诱导HUVEC血管发生VEGF和bFGF是目前公认的具有刺激血管发生作用的生长因子。它们的作用具有相加作用。我们发现用FN预先包被的培养板上，在含1FCS的F12液中同时加入bFGF10gL和VEGF15gL能成功地诱导内皮细胞血管发生。经上述处理的内皮细胞增生能力明显下降，同时贴壁细胞的形态也发生了显著的改变，表现

12、为细胞拉长，相邻的细胞间常以管状结构相互联接，胞体不规则并有芽生状管状结构伸出，这种管状结构不断延伸，随后延胞体纵轴常可见有透明的空泡或裂隙出现，排列成行或交织成网状（1）。目前认为内皮细胞的这些改变类似于其在体内血管发生过程中的变化，可以作为体外研究内皮细胞血管发生的基本模型511。故本项研究中我们采用这一模型来观察不同免疫抑制剂对内皮细胞血管发生的影响。Fig1AngiogenesisofendothelialcellsEndothelialcellsalignedthemselvesendtoendandelongated，thesproutsfromdifferentcellsconn

13、ectedtoformanetwork（phasecontrast，×200）22霉酚酸、地塞米松对HUVEC血管发生的影响我们分别以内皮细胞芽生状管状结构数目和管状结构长度为指标，观察了霉酚酸和地塞米松对内皮细胞血管发生的影响。虽然，霉酚酸和地塞米松对血管发生均有抑制作用，但其作用特点仍不尽相同。霉酚酸的作用比地塞米松强，尤其在抑制内皮细胞管状结构方面。而地塞米松在维持细胞生存状态方面比霉酚酸强，细胞在120h时仍大都存活，而霉酚酸处理的细胞则在108h就大部分脱落了（2A，B）。Fig2TheeffectofMMFandDEXonangiogenesisofHUVECinvitr

14、oAsproutsnumberfield，Bsproutlengthfield23霉酚酸及地塞米松对HUVEC迁移能力的影响本实验我们以划伤愈复测定检测两种免疫抑制剂对HUVEC迁移能力的影响。实验中，融合状态的HUVEC以无血清F12静止后划伤，再继续孵育于无血清F12培养液中以抑制细胞增生，此时观察到的HUVEC间划痕的缩窄即可反映细胞的迁移能力：细胞迁移能力越强，划痕的缩窄便越显著。我们的实验结果显示：地塞米松处理对HUVEC迁移能力无明显影响，在48h里，地塞米松10 molL处理组HUVEC的划痕缩窄了30.8，而地塞米松10 molL处理组的划痕缩窄了29.8与正常对照组比无显著性

15、差异，而霉酚酸两组剂量的处理组均可使HUVEC的迁移能力明显降低，这一效应在第二天时更为显著，且具有剂量依赖关系（表1）。Table1TheeffectofMMFandDEXonthemigrationabilityofHUVEC（n3）Treatment0-24h24h-48h0-48hControl13.815.214.5DEX105M14.616.215.4DEX106M15.614.214.9MMF10M9.28.9*9.1*MMF5010.67.1*8.8*P0.05 vscontrol 24霉酚酸及地塞米松对HUVEC体外增生能力的影响本实验中以3H-TdR掺入法测定了两种免疫抑制

16、剂对HUVEC增生能力的影响。结果发现：地塞米松对HUVEC增生没有明显的影响，而霉酚酸则能显著的抑制HUVEC的增生（3）。Fig3TheeffectofMMFandDEXontheproliferationofHUVECinvitro1：control；2：DEX1molL；3：DEX10 molL；4：MMF10 molL；5：MMF50molL*P0.05，vs13讨论内皮细胞增生是血管炎症反应的一个常见现象。在缺氧，炎症因子刺激下可使局部VEGF产生增多，使血管的通透性增加，继而以血管再生的形式参与血管炎症损伤反应。在这个过程中往往伴随有细胞外基质增生和内皮细胞的迁移12，13。肾脏

17、是一个血运非常丰富的器官，肾小球独特的二级毛细血管网结构使内皮细胞功能及其调控机制在肾脏病理情况下显得尤为重要14，15。免疫抑制剂的应用是肾脏疾病治疗中的一个重要环节。以往有关免疫抑制剂作用机制的研究更多的还是局限于其对机体免疫活性细胞的影响。事实上，许多免疫抑制剂的作用是比较广泛的：MMF不仅可以抑制细胞核酸代谢途径中的限速酶（IMPDH）抑制淋巴细胞增生，而且还能通过抑制细胞内糖蛋白的合成，从而抑制多种粘附分子如E-选择素，P-选择素，ICAM-1和VCAM-1及其配体的合成。此外，MMF对肾小球系膜细胞，血管平滑肌细胞的增生也有抑制作用3，4。MMF对狼疮性肾炎及其它血管炎显著的疗效提

18、示血管内皮细胞有可能是它的效应器官之一1，2，16。然而有关MMF对血管内皮细胞功能的影响目前尚无完整的报道。为了进一步较全面的验证这个问题，我们首先建立了内皮细胞血管发生的体外模型。内皮细胞在低血清浓度诱导和bFGF及VEGF的刺激下，逐渐呈现出典型的血管发生的形态学改变。借助这个模型我们发现MMF能够显著抑制内皮细胞血管发生，并且此作用明显强于地塞米松。不仅如此，MMF对内皮细胞增生和内皮细胞迁移能力均有显著的抑制作用，而地塞米松则没有上述作用。以上结果表明，MMF与地塞米松对内皮细胞的作用存在着显著差异。MMF对血管内皮细胞具有多重直接作用：MMF不仅可以抑制内皮细胞增生，而且对内皮细胞

19、迁移能力以及血管发生均有较强的抑制作用。本项研究以内皮细胞为研究对象，论证了霉酚酸酯不同于地塞米松，对内皮细胞增生、迁移和内皮细胞血管发生等诸多方面均具有显著的抑制作用。上述机制的阐明有助于我们进一步认识霉酚酸酯的临床疗效，也为临床合理应用霉酚酸酯提供了依据。刘浩（南京大学医学院博士研究生）刘志红（南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所南京，210002）黄海东（南京大学医学院博士研究生）陈朝红（南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所南京，210002）李颖健（南京大学医学院博士研究生）黎磊石（南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所南京，210002）参考文献1，胡伟新，刘志红，陈惠萍等霉酚酸酯治疗

20、顽固性型狼疮性肾炎肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7：4272，胡伟新，唐政，章海涛等霉酚酸酯治疗ANCA阳性重型狼疮性肾炎的初步临床观察肾脏病与透析肾移植杂志，1999，8：4323，Hauser IA， Sterzel RB Mycophenolate mofetil： therapeutic applications in kidney transplantation and immune-mediated renal disease Curr Opin Nephrol Hypertens，1999，8：14，Jayne D Non-transplant uses of mycophe

21、nolate mofetil Curr Opin Nephrol Hypertens，1999，8：5635，Nguyen M， Strubel NA， Bischoff J A role for sialy Lewis-XA glycoconjugates in capillary morphogenesis Nature，1993，365：2676，Mandriota SJ， Pepper MS Vascular endothelial growth factor induced in vitro angiogenesis and plasminogen activator express

22、ion are dependent on endogenous basic fibroblast growth factor J Cell Sci，1997，110：22937，Pepper MS， Ferrara N， Orci L et alPotent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro Biochem Biophys Res Commun，1992，189：8248

23、，Folkman J， Haudenschild C Angiogenesis in vitro Nature，1980，288：5519， Folkman J， Ingber DE Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro：role of extracellular matrix J Cell Biol，1989，109：31710，Choi ME， Ballerman BJ Inhibition of capillary morphogenesis and associated apoptosis by dominant negative mutant transforming growth factor- receptors J Biol Chem，1995，270：2115011，Nguyen M， Folkman J， Bischoff J 1-Deoxymannojirimycin inhibits capillary tube formation in vitro J Biol Chem， 1992，267：2615712，Ca