分子生物学电子教案第十章

1、第十章 原核生物基因表达调控1课程教学内容 (1) 原核生物基因表达调控的概述 (2) 乳糖操纵子 (3) 色氨酸操纵子的负调控 (4) 阿拉伯糖的操纵子 (5) 正调控系统和负调控系统 2课程重点、难点 原核生物基因表达调控的一般机制、乳糖操纵子、色氨酸操纵子的负调控。 3课程教学要求 （1）掌握原核生物表达调控的特点、方式和意义及相关概念； （2）掌握和理解乳糖操纵子和色氨酸操纵子的结构和作用机理； （3）了解其它调控方式。   原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少。如大肠杆菌基因组约为4.6×106bp，假如每个基因长1000bp，一个细菌就有4000个左右的

2、基因能合成4000种左右的蛋白质，据估计一个细胞中总共含有107个蛋白质分子，如果每个基因等同翻译的话，任何一个多肽应有2500个拷贝，但是这些蛋白质并不是以相同拷贝存在于每个细胞中，有些蛋白质数目相当固定，另一些变化很大。例如，每个大肠杆菌细胞可以有约15000个核糖体，与其结合的约50种核糖体蛋白数量是十分恒定的，糖酵解体系的酶含量很大，其数目也极恒定，此外，如DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中十分必需的酶或蛋白质，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质的合成称为永久型，另一类型则称为适应型或调节型 ，这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。例如，一般情况下，一

3、个大肠杆菌细胞中只有1-5个分子的-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含有乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万分子，其他糖代谢的酶、氨基酸、核苷酸合成系统的酶类，其合成速度和总量都随培养条件的变化而改变。细菌中所利用的大多数基本调控机制执行下列规则，一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭，这种“开-关”活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。实际上，当我们说一个系统处于“off”状态时，也有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子，因而合成少量蛋白质分子，为了方便，我们通常用“off”这一术语，但必须明白所谓“关”实际意思是基因表达是特别

4、低，很难甚至无法检测。所有生物的遗传信息，都是以基因的形式储藏在细胞内的DNA分子中。随着个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息通过密码子反密码子实验，转变为蛋白质分子，执行各种生理生化功能完成生命的全过程。科学家把这个DNA到蛋白质的过程称为基因表达，对这个过程的控制称为基因表达调控时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。基因表调控主要表现在以下几个方面（1）转录水平上的调控（2）mRNA加工成熟水平上的调控（3）翻译水平上的调控基因调控的指挥系统也是多样的，不同的生物使用不同的信号来指挥基因调控。原核生物中，营养状况和环境因素对基因表

5、达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中激素水平和发育阶段是基因表达调控的最得要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。一、        原核基因调控总论 基因表达的第一步是遗传信息从DNA分子转移到RNA分子的转录过程，这种RNA分子中一条反义链为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化作用下进行的一种聚合反应，转录的可靠性是一个十分复杂的问题，它包括以下几个方面（1）       如何在复杂的核基因组内确定正确的转录起始位点？（2） 

6、60;     如何将核苷酸按照密码子序列插入新生的RNA链中？（3）       如何使RNA聚合反应进行到底即如何保证合成完整的RNA？（4）       如何确定转录的终止？这种在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。在研究转录及转录调控以前，我们先来分析一下原核与真核生物转录与翻译的特点：因为细菌mRNA在形成过程中与核糖体混合在一起，所以细菌的转录与翻译过程几乎发

7、生在同一个时间间隔内，转录与翻译相偶联；真核生物中，转录产物只有从核内运到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。（图解） （一）转录调节的类型 根据某一体系代谢活性调节的类型，转录水平上的调节可分为如下几种方式：（1）代谢产物对基因活性的调节；（2）弱化因子对基因活性的影响；（3）降解物对基因活性的调节；（4）细菌的应急反应。1、 代谢产物对基因活性的调节 在降解代谢途径中，起始端的酶（一般指催化第一步反应的酶）的底物浓度往往决定是否合成这一途径中的其他各种酶。相反，在合成代谢中，最终产物则往往是调节物质。在单顺反子mRNA翻译出蛋白质的体系中，该蛋白质可以充当自我调节的角色，其浓度决定了

8、启动子的转录活性，每一调节类型的分子机理相差甚远。但一般可以分为负调节与正调节两种情况。在负调节体系中，细胞中存在着抑制物，它使转录处于关闭状态，抗抑制物通常称为诱导物，在转录的开启中发挥重要作用。在正调节体系中，一个效应物分子激活启动子，而抑制物也在正调节中起作用，正负调节之间并不相互排斥，有些系统中既有正调节，也有负调节，因而需要两种调节物。调节类型及其特点调节物结合到DNA上正调节负调节是开启关闭否关闭开启通过特殊代谢物调节的基因活性主要有可诱导和可阻遇两大类：（1）可诱导调节：是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。这

9、类基因中最突出的例子是大肠杆菌的乳核操纵子。大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中可以长得很好，在只含乳糖的培养基中，开始时生长不好，直到合成了利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源的能力，才能在这一培养基中生存下来，细菌获得这一能力的原因就是因为在诱导物乳糖的诱导作用下，开动了乳糖操纵子，表达它编码的3个酶：半乳糖苷酶（使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖）；半乳糖苷透过酶（使乳糖进入细菌细胞内）；半乳糖苷乙酰基转移酶（使半乳糖第6位碳原子乙酰化）。这个操纵子开动的效果是十分明显的，以半乳糖苷酶为例在葡萄糖培养基中生长时，每个细胞只有几个酶分子，但若转移到乳糖培养基中，几分钟后，每个细菌细胞内可产生300

10、0个酶分子，这一类基因称为可诱导基因，这类酶称为诱导酶，这种生化过程称为酶的诱导过程。（2）可阻遏调节：这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。如大肠杆菌色氨酸的合成，色氨酸为生活中必需的氨基酸，所以它的操纵子是一直开启着的。当细菌的培养基中加入色氨酸，于是细菌完全可以利用培养基中现成的色氨酸来维持，无需化力气来合成。这种基因称为阻遏基因，这些酶称为可阻遏酶，这个现象称为可阻遏现象，这些起阻遏作用的小分子称为抑制物。一般规律：（1）可诱导的操纵子是一些编码糖和氨基酸水解代谢蛋白的基因，这些糖和氨基

11、酸平时含量很少，因此，细菌总是利用更一般的能源物质葡萄糖的水解来提供能量，所以这些操纵子常常是关闭的，但当生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖作为能源时，就要打开这些基因；（2）可阻遏基因情况恰好相反，它们是一些合成各种细胞代谢过程中所必需的小分子物质的基因，由于这些小分子物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的，当这些小分子在细菌生活环境中含量较高时，就关闭这些基因，停止其合成。2、 弱化因子对基因活性的影响 属这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子和缬氨酸操纵子，以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵

12、子等。在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨基酰tRNA的浓度，如色氨酸操纵子中是色氨酰tRNA浓度，当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸称为弱化子，这种因为核糖体在基因转录产物的不同位置，决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构，并由此决定基因能否继续转录的调节方式确定是异常巧妙的，起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶浓度只要稍加变动就可影响整个体系的功能。3、 降解物对基因活性的调节 操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中解脱出来进行转录，是从负调节的角度来考虑基因表达调控的，那么有没有从相反的角度进行调节，从而提高基因的转录水平

13、，使它由原来的低水平表达变成高水平表达的呢？这就是降解物抑制作用的调节。有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，产生通过代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用的调节。添加葡萄糖后，细菌所需要的能量便可从葡萄糖得到满足，葡萄糖是最方便能源，细菌无需开动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。由于葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶，减少环腺苷酸（cAMP）的合成，与它结合的蛋白质（cAMP受体蛋白）因找不到配体而不能形成复合物，这个复合物是一个正调节物质，可以与操纵子上的启动区结合，起动基因转录，所以有

14、葡萄糖存在时，不易形成复合物cAMPCRP形成复合物并与启动子结合，促进乳糖操纵子的表达，降解物抑制作用是通过促进基因转录来正调节基因表达的，这是一种积极的调节方式。4、 细菌的应急反应 上面讲述的是细菌处于正常生活条件下的基因表达调节方式，所谓“正常”也包括生活环境中缺少某一种或两种能源，但能找到其他代用物。可是细菌有时会碰到万分紧急的状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一、二个氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏，为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA，糖脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（pppGpp）和鸟

15、苷五磷酸（pppGpp）。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使pppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。ppGpp的出现会出现关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况，关于PPGpp的作用原理还不太清楚。据认为RNA聚合酶有不同的构型，这些构象可以识别不同的启动子区，ppGpp与RNA聚合酶结合会使它的某些构象稳定下来，从而改变了基因转录的效率，或关闭，或减弱，或增加；也有人认为，基因的转录起始附近有一些保守序列，它们可能是ppGpp或有关调节蛋白的结合位点，当这些信

16、点上的启动子与ppGpp结合后，就使它们不再与RNA聚合酶结合，基因被关闭，与的作用范围十分广泛，它不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。（二）环腺苷酸受体蛋白对转录的调控 环腺苷酸（CAMP）受体蛋白（CRP）并称分解代谢激活蛋白（CAP），当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中，CAMP合成量增加，与CRP结合后所形成的复合物具有激活半乳糖（gal）、麦芽糖、乳糖（lac）等启动子的功能，它是由两个相同亚基组成的二聚体，每个亚基含有210个氨基酸残基，分为两个结构域，氨基末端结构域与CAMP结合，羧基末端结构域与DNA结合，cAMP的结合能提高CRP对双链DNA

17、的亲和力，CRP与启动子结合是激活转录的必需条件。根据17个能与CRP结合只启动子序列进行分析的结果表明，存在以5TGTGANNTNNNCANAT 3为特征的共同序列，其中TGTGA保守性最强。 一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征，因此，大肠杆菌RNA聚合酶难以与其结合，CRP的存在能显著提高酶与启动子的结合常数，有研究证明，CRP与 Lac启动子的最强结合区域达到2830bp，结合后能使DNA做90180的弯曲，为酶分子提供结合部位，另一方面，酶的存在又提高了CAMPCRP与lac和gal启动子的亲和力，在cAMP存在的条件下，酶能与CRP共沉淀，这些事实说

18、明，酶与CRP可以发生相互作用，由此推想，CRP通过改变启动子构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向以便与-10区结合实际，起到了取代-35区功能的作用。 CRP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其他位点的结合，从而提高与某一特定启动子结合概率。 二、 乳糖操纵子 操纵子学说是，关于原核生物基因结构及其表达调控的学说，它是由法国巴斯德研究所著名科学家Jacob和Monod在1961年首先提出，并在10年内经许多科学家的补充和修正得以逐步完善。大肠杆菌乳糖操纵子（lectose operon）包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等，转录时RNA聚合酶首先与启动区（P）结合，通过

19、操纵区（O）向右转录，转录从O区的中间开始，按ZYA，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因，转录的调控是在启动区和操纵区进行的。（图解）3个结构基因各决定一种酶：Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶； A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。-半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖果水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷，-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内，所以大肠杆菌如半乳糖为碳源和能源的话，以上两酶是必需的。-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的利用中

20、并非必须。（一）酶的诱导Lac体系受调控的证据 1、 Lac基因的诱导表达 乳糖代谢体系的开启和关闭的过程如下：（1）在不含乳糖及-乳糖的培养基中，Lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有1-2个酶分子，但是，如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。（2）有乳糖供应时，在无葡萄糖培养基中生长的Lac+细菌，-半乳糖苷酶和透过酶将同时合成，进一步用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖12min后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的LacmRNA量就明显迅速增加，去

21、掉乳糖后，LacmRNA量立即下降到几乎无法检测，表明乳糖确定能激发LacmRNA的合成，科学家对于这个操纵子诱导作用的机理奠定了我们对代谢调节认识的基石。实验室里通常使用含硫的乳糖类似物异丙基巯基半乳糖苷（IPTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG），另外，在酶活性分析中通常用生色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。研究发现，它们都是高效诱导物，因为这些都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物。（3）为了证实诱导物的作用是诱导新酶合成，而不是将已存在于细胞中的酶前体转化为有活性的酶，设计了同位素示诱实验，把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖苷诱导物的培养基中，随着培养基

22、中诱导物的加入，-半乳糖苷酶便开始合成，分离纯化-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记，说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。2、 I型和O型的发现及其意义 已经分离到一种在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生LacmRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，Jacob和Monod用这两种突变体构建了各种局部二倍体细胞，并将这些突变株归纳为两类：I型和O型，为了和野生型相区别，两类突变型分别以下列符号标记：I型：野生型为I+，突变型为I；O型：野生型为O+，突变型为Oc。这样的突变往往是多效性突变，因为I+ I 或O+Oc后，Z、Y、A结构基因均表

23、现为永久表达，所以I基因被称为调节基因（regnlatory gene）。I 突变株的行为像大多数基因的隐性突变那样，当I+ 细胞停止LacmRNA的合成时，I突变体中仍然有LacmRNA合成，很显然，I基因是一个产生抑制物的调节基因，其产物使体系关闭，I 突变体由于不能产生这种抑制物，细胞因此成为Lac永久型，在I+/ I 的局部二位体中有一个正常的I基因，Lac操纵子的表达仍然可能被抑制。Jocob和Monod称I基因产物为Lac阻遏物，最初人们还不清楚Lac阻遏物究竟是一种蛋白质还是一种由I基因转录形成的RNA分子，后来发现此基因有琥珀突变体，初步证明了是一种蛋白质，1967年，人们首次

24、分离到了阻遏物，并使之纯化。OC突变体的一个显著特征是某些情况下表现出显性，这些OC 突变体显性特征的重要意义在某些二倍体中更加清楚，这两种组合由于有功能正常Z基因而表现为Lac+。但OCZ/O+Z+，尽管有OC突变存在，-半乳糖苷酶的合成仍然是可诱导型的两个组合的差异在于OC突变存与Z突变处于同一个DNA分子中，而7种OC与Z+在同一个DNA分子上，所以只有当OC与Z+在同一个DNA分子上时，OC才能引起半乳糖苷酶的永久型合成。有一个重要的实验证实了一个结论，检测-半乳糖苷酶突变型的免疫系结果表明，在OCZ/O+Z+的局部二倍体中，有突变酶永久型合成，而只有加入诱导物之后，才能会合成野生型的

25、酶，关于OC突变位于I与Z之间 ，所以Lac体系的4个基因序列为IOZY，通过这些观察，Jocob和Monod推断OC突变代表DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个基因，因为可编码的基因具有互补性，而OC没有这一特性，O决定相邻Z基因产物是诱导型合成还是永久型合成，O区域称为操纵基因。（二）操纵子模型 Jacob和Monod认为诱导酶现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，通过大量的实验，终于建立了操纵子的控制模型（图解）。其要点为： （1）Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码； （2）这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P）

26、，不能单独起动合成-半乳糖苷酶和透性酶的生理过程。 （3）操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点； （4）当阻遏物与操纵基因结合时，LacmRNA的转录起始受到抑制； （5）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发LacmRNA的合成，即有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能移顺利起始mRNA的合成。 这一简单模型解释了Lac体系及其他负调控系统的许多现象，但是在乳糖操纵子中同样也存在着正调控。 1、 Lac操纵子的本底水平表达 有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的，首先，诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结

27、合，而转运诱导物需要透过物，后者的合成又需要诱导，这样必须解释第一个诱导物是如何达到细胞内的，只有两种可能，或者一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞，或者一些透过酶可以在没有诱导物的情下合成，后者的解释是正确的。 其次，研究还发现乳糖，并不和阻遏物结合，真正的诱导物是乳糖的异构体异构乳糖，但是，异构乳糖是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。因此，乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成需要有-半乳糖苷酶的预先存在。这一现象的解释是：在非诱导状态下有少量的LacmRNA合成（大约每代有15个mRNA分子），这种合成称之为本底水平的永久型合成。 2、 Lac+大肠杆菌对乳糖的反应 假设细菌生长以甘油

28、为碳源的培养基中，按照Lac操纵子本底水平的表达，每个细胞可有几个分子的-半乳糖苷酶和乳糖透过酶，加入乳糖在单个透过酶分子作用下，少量乳糖分子进入细胞，又在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成异构乳糖，某个异构乳糖与操纵基因上的阻遏物结合，并使后者失活而离开基因，这样mRNA的合成就开始了，这些mRNA分子编码大量的-半乳糖苷酶及乳糖透过酶，其结果是乳糖涌入细胞，又在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成异构乳糖，然后与细胞内的阻遏物结合，阻遏物的失活促进mRNA的高速合成，进一步提高了透过酶和-半乳糖苷酶的浓度降解产生的葡萄糖被细胞用作碳源和能源，降解产生的半乳糖则被另一套酶体系转变成葡萄糖，这些

29、酶的合成也是可诱导的，这个可诱导的体系就是半乳糖操纵子，半乳糖是它的诱导物。 3、 Lac阻遏物I基因产物及功能 一般通过与放射性标记的IPTG相结合的方法分离和纯化阻遏物，Lac阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合，未经分级分离的细胞提取物的结合能力大约为每细胞结合2040个IPTG分子，因此推断每个细胞中有510个阻遏物分子，进一步观察发现在某I突变体的细胞提取物中缺少阻遏物，从而证明了它与IPTG结合的分子确定是蛋白质。 由于阻遏物含量极低，一般认为每个细胞中这些蛋白质分子是由12个被转录的阻遏物mRNA模板翻译而来的。mRNA的

30、数量如此之少，因此很可能阻遏物的合成也受到调节，或者这种mRNA是从一个弱启动子转录而来的。现已表明，Lac操纵子阻遏物mRNA是一个弱启动子控制下永久型合成的。 4、 葡萄糖对Lac操纵子的影响 -半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是降解乳糖，形成葡萄糖及半乳糖，如果将葡萄糖及乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前，不会诱发Lac操纵子，当有葡萄糖存在时，因为没有LacmRNA合成，所以也没有-半乳糖苷酶产生。 葡糖对LacmRNA转录的抑制可能来自两个方面：（1）葡萄糖阻止了诱导物引起的阻遏物失活效应；（2）仅仅去掉阻遏物并不能启动Lac基因表达，还有其他因素参与调控这一基

31、因表达。 葡萄糖对Lac操纵子表达的抑制是间接的，如：有一个E. coli突变体，它在糖酵解途径中不能将葡萄糖-6-磷酸转变成下一步代谢中间物，这些细菌的Lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成，所以不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制了LacmRNA的合成，我们把葡萄糖的这种效应称之为代谢阻遏效应。 5、 cAMP与代谢物激活蛋白 广泛存在于动、植物组织中的cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下转变而来的，在许多真核生物激素调节过程中起着重要作用，它也存在于大肠杆菌中，其浓度受葡萄糖代谢的调节，如果将细菌放入缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP浓度非常高。如果在含葡萄糖的培养基中培养，cAM

32、P的浓度就很低，如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度也会很高，因此，推测糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶活性的抑制剂。 大肠杆菌中的分解代谢物激活蛋白，由crp基因编码，能与cAMP形成复合物，凡crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成LacmRNA，CAP和cAMP都是合成LacmRNA所必需的，事实上，cAMP-CAP复合物是Lac体系中一个有活性的复合物，细菌对此复合物的重要是独立的，与阻遏体无关，因为crp基因和环化酶基因的突变细菌即使同时也是L或OC突变，仍然不能合成出LacmRNA，转录必须有cAMP-CAP复

33、合物结合在DNA的启动子区域上，所以认为cAMP-CAP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而Lac操纵子的功能是正负两个相互独立的调控体系作用下实现的。 （三） Lac操纵子DNA的调控区域P、O区 现在利用分子生物学技术已经分离得到含有Lac操纵子DNA片段，其P-O区核苷酸序列已全部分析清楚，P区是从I基因结束到mRNA转录起始位点，共长82bp，O区就是阻遏物结合区，位于P区后半部和转录起始区。把mRNA起始到结构基因起始密码子之间的序列称为前导区（Leader），P区是从-82 +1，阻遏物结合区大约从-7 + 28。该区（-7 + 28）的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对，P

34、区的cAMP-CAP复合物结合区（-67 -52）也有一个对称区，其对称轴在-60 -59之间，对称区在蛋白质与DNA的识别和结合中有重要意义。在反应体系中先加入阻遏物，后加入RNA聚合酶，体系无转录活性，反之若先加RNA聚合酶，后加阻遏物，体系有转录活性。已知PO区有7bp重迭，很可能阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与Pribnow区紧密结合形成稳定的起始复合物，gal操纵子的PO区也是紧密相连并有重叠现象，面而trp操纵子的O区则完全在P区内。Lac操纵子的调控区有几个值得注意的特点： （1）       mRNA合成的起始位

35、点在操纵基因中，当阻遏物蛋白存在时，该位点被阻遏物占据。 （2）       若RNA聚合酶预先结合在启动子区域，阻遏物无法与操纵基因结合。（3）       cAMPCAP的结合位点非常接近于RNA聚合酶的作用位点，但不与之重合。（4）       整个调节区域的长度为115bp，约为DNA螺旋的12圈。（5）       这一区域的序列为IPOZ，这个序

36、列与遗传分析的结果相吻合。三、TrP操纵子 色氨酸操纵子（tryptophane operon）负责色氨酸的生物合成，它的激活与否完全根据培养基中有无色氨酸而定，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，在这里色氨酸与其代谢有关的某种物质在阻遏过程中起作用，由于trp参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。色氨酸的合成分5步完成，每个环节需要一个酶编码，这5种酶的基因是紧密连锁在一起的，所以5个基因被转录在一条多顺反子mRNA分子上，分别以trpE、trpO、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶，邻氨基

37、苯甲酸焦磷酸合成酶，trpE基因是第一个被翻译的基因和trpE紧邻酸是启动子区和操纵区。另外前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa（不是trpA），trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上25min处，而前者则位于90min处，在位于65min处还有一个trpS（色aatRNA合成酶），它和携带有trp的tRNATrp也参与trp操纵子的调控作用（图解）。trp操纵子的转录调控除了阻遏系统以外，还有弱化系统（图解）。L区编码了前导肽，当有高浓度Trp存在时，由于弱化子a的作用，转录迅速减弱停止，生成140核苷酸的前导RNA，当Trp浓度

38、较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成约7kb的mRNA，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG在+162处。（一）trp操纵子的阻遏系统 trp基因突变常引起trpmRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白（aporepressor）除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏物不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并使之关闭转录trpmRNA。辅阻遏蛋白 + 操纵区 有活性的操纵区（能发生转录）辅阻遏蛋白 + 色氨酸 有活性阻遏物 + 操纵区 （操纵区无活性，不发生转录） 如果停止或大幅度减少外源色氨酸的供应，以上反应的平衡向左移动，操纵区的

39、位置空出来，又开始转录，这就是基本的开关调节机理。 启动子与操纵区的区域有很大程度的重叠，有活性阻遏物的结合与RNA聚合酶的结合同样发生竞争。在体外，如果先加入阻遏物，则RNA聚合酶不能结合，反过来则阻遏物不能结合。 Trp操纵子调节基因碱基序列，操纵区20bp的18bp形成了反面重复的对称结构。 Trp操纵子调节基因碱基序列（图解） 阻遏操纵机制对trp来说是一个一级的开关，主管转录是否启动，相当于Trp操纵子的粗调开关，Trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细调控，这种细调控主管已经启动的转录是否继续下去，在这个系统中，酶的浓度根据氨基酸的变化而变化，这个细调控是通过转录达

40、到每个结构基因之前的过早终止来实现的，由Trp的浓度来调节这种过早终止的频率。 （二）弱化子（衰减子）与前导肽 1、弱化子 trpmRNA5TrpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中碱基序列123-150位如果缺失，trp基因表达可提高6倍，而且无论是在阻遏细胞内还是永久性突变的细胞内都是这样（即无论trpR 或trpR ）。研究发现当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录，这就是123150序列缺失会提高trp基因表达的原因，因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被

41、调节的，这个区域就被称为弱化子。 研究引起终止的mRNA 基序列，发现此区mRNA通过自我配对，可以形成茎一环结构，有典型的终止子特点。 2、前导肽 各种实验表明衰减作用需要有负载tRNATrp参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了， 分析前导序列，发现它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，如果翻译起始于AUG，应该产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假说的多肽（还未实际观察到）被称为前导肽，在mRNA上AUG位点5端有一个核糖体结合位点，此外，前导肽编码区与trpE基因5端融合可产生一种融合蛋白质，该蛋白质具有与前导肽同样的N未端序列。 前导序列具有一个非常有意义的特点，在其第10和第

42、11位上有抑制的两个色氨酸密码子，这一点很重要，因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列，此序列中含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有7个苯丙氨酸密码子。 3、 mRNA前导区的序列分析 trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种以上的不同方式进行碱基配对，有时以12和34配对，有时只以23方式互补配对（图解）。Rnase降解实验（此酶不能水解配对的RNA）表明纯化的Trp前导序列中只有12和34的配对方式，由此定位的34配对区正好位于终止密码子的识别区，当这

43、个区域发生破坏自我配对，碱基突变时有利于转录的继续进行。 4、 转录衰减作用 这一理论认为mRNA转录终止是通过前导肽基因的翻译来调节的，因为前导肽基因中有两个相 邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNATRP的浓度敏感，当培养基中色氨酸浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATRP也就少，这样翻译通过两个相邻的色氨酸密码子的速度就会很慢。当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区，这时的前导区结构不形成34配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将Trp操纵子中的结构基因全部转录，当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之间，核糖体就达到2区

44、，这样使23不能配对，34区可以自由配对形成第一环状终止子结构，转录停止。trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸，所以弱化子对RNA聚合酶的影响前导肽翻译中核糖体所处的位置。 大肠杆菌和沙门氏杆菌中，陆续发现了不少操纵子中具有弱化作用，从前导区序列可以看到它们都具有前导肽。 （三）阻遏作用与衰减作用的协调 有实验证明，在不加Trp的培养基中，trpmRNA的合成仍然受到部分阻遏，因为有一个无阻遏物活性的突变细胞系中，trp合成酶浓度要高在野生型细胞中10倍以上。事实上，现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾

45、斜，最终做在关闭或启动trp操纵子的决定，从而维持一定的trp含量。细菌为什么需要有弱化子系统呢？一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转录速度极低，需要有一个能更快地做在反应的系统，以保持培养基中适当的色aa水平，也有可能弱化子系统主要是对外源色aa浓度做在反应，但是这个信号还不足以很快引发内源色aa的合成，于是在这种环境下，衰减子就通过抗终止的办法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨酸浓度。阻遏物的作用目前认为是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济，它拥有功能上与Trp操纵子完全相同的弱化子，这个弱化子能够形成一个有3个碱基配对的区域，组氨酸操纵

46、子没有阻遏物，这就说明完全受弱化子调节。四、    其它操纵子 （一）半乳糖操纵子 大肠杆菌半乳糖操纵子（galactose operon）在大肠杆菌遗传图上位于17min处，包括3个结构基因：（1）异构酶（UDPgalactose，galE）；（2）半乳糖激酶（galactose Rinase，galK）；（3）半乳糖磷酸尿嘧啶核苷转移酶（galactosetramferanse，galT），这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸，半乳糖操纵子的调节基因是galR位于遗传图上35min处，gal操纵子与lac操纵子所不同的是galR与galE、T、K及操纵

47、区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacIlacO的作用相同，因为在galR和galOC突变体中E、T、K基因得到永久性表达。gal操纵子的诱导物主要是半乳糖。gal操纵子还有两个特点：（1）具有两个启动子，其mRNA可以从两个不同的起始点开始转录；（2）它有两个O区，一个在P区上游-67-53，另一个在结构基因galE内部。1、 cAMP-CRP对gal启动子的作用 因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal操纵子仍可被诱导，现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶

48、类（gal结构基因高效表达）；而另一类突变株中gal基因的表达不依赖半乳糖代谢酶类。据此科学家认为gal操纵子存在着两个启动子，对这个操纵子的PO区进行碱基序列分析，证实确有两个相距仅为5bp的启动子，gal操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录，每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2，cAMP-CRP对S1和S2起始转录有不同的作用。 从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时才顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CRP和较高浓度的cAMP。当腺苷环化酶突变（cya）或cAMP受体蛋白（crp）时，gal操纵子不能以S1起始转录，此时如在体外系统中加入cAMP-CRP就能

49、够促进从S1起始的转录。 从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制由这个启动子起始的转录。CAMP-CRP在gal操纵子中所起的调节作用比在lac操纵子中更为复杂，大肠杆菌的cya或crp突变型不能利用乳糖，但可以利用半乳糖作唯一碳源。CAMP-CRP能够刺激gal操纵子转录，用含有gal操纵子调节区的DNA片段作模板进行体外转录时，发现cAMP-CRP抑制从S2的转录而刺激从S1的转录，当有cAMP-CRP时，转录从S1开始，当cAMP-CRP时转录从S2开始。有一个gal启动子突变株，不能利用培养基中的半乳糖，若将此突变株再行突变为cya 或crp，细胞恢复了利用

50、半乳糖的能力，这很可能是由于第一次突变失去了从S1起始转录的能力，但并不影响从S2起始转录能力，该株不能利用半乳糖是因为cAMPCRP的存在抑制了从S2开始的基因转录，使gal操纵子既不能从S1起始，又无法从S2开始基因转录。双重突变后，无论是cya突变，还是crp突变都能够去cAMPCRP对S2的阻遏作用，导致gal基因表达恢复利用半乳糖作为能源的能力。对这一突变体启动区核苷酸序列分析的结果支持了上述观点，已知突变发生在-11位核苷酸，使原来的A突变为T，这个位点是Pribnow区S1区的第二位核苷酸，已知许多启动子中这一核苷酸的保守性很强，AT毫无疑问带来了功能上的改变，导致不能从S1处开

51、始转录。虽然这一核苷酸也是Pribnow区，S2区的第七位核苷酸，从其他启动子核苷酸的变化情况看，这个位点A T变化并不影响S2区RNA聚合酶的结合和转录起始活性。2、 双启动子的生理功能 gal的双启动子很可能与半乳糖在细胞代谢中的双重作用有关，半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖向异构酶的作用，由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物，因此生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。另一方面，因为合成细胞壁过程中对异构酶的需要量很小，本

52、底水平的永久型合成就能够满足生理需要，实际上，galmRNA的永久合成水平已高于lac操纵子所合成lacmRNA的水平，显然这个mRNA是在没有半乳糖的情况下合成的。（二）阿拉伯糖操纵子 阿拉伯糖（arabinose）是另一个可为代谢提供碳源的五碳糖，在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA、araD，它们形成一个基因簇，简写为araBAD，它们分别编码3个酶：araB基因编码核酮糖激酶，araA编码L阿拉伯糖异构酶，araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差 异构酶。在gal操纵子中，基因的排列序列就是代谢途径中酶的作用序列，而这个操纵子却不同。阿拉伯糖代谢是以araA、ar

53、aB、araD的序列进行的，另外还有负责将阿拉伯糖透入细胞的基因即araE和araF，它们位于远离这个基因簇的地方，araE和araF分别编码一个膜蛋白和一个位于细胞壁与细胞膜之间的阿拉伯糖结合蛋白。 与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域和一个调节基因araC这个调节基因的性质与前面的Lac及gal操纵子中的调节基因的性质全然不同，AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能，与之相反在Lac和gal操纵子中，阻遏蛋白只能作为负调节因子，而cAMPCRP蛋白只能是正调节因子，araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。 Ara操纵子也是可诱导的，阿拉伯糖本身就是诱导物

54、，在野生型操纵子中，只有阿拉伯糖存在时才转录在araBADmRNA，而有葡萄糖存在时则不转录，在腺苷酸环化酶的缺陷型和Crp突变株也不形成araBADmRNA，说明以PBAD起始的转录过程也重要cAMP-CRP。 AraC蛋白说明ara操纵子的正负调节蛋白，又是它们负调节蛋白。（图解） 五、    转录后调控 原核生物的基因表达调控虽然主要表现在转录水平上，但也有一些转录后的调控机制。 （一）稀有密码子对翻译的影响 翻译水平上的调控大致可分为两类：即固定式和非固定式调控。固定式调控机制包括在DNA序列之内，如稀有密码子和重叠基因的使用等调控不受环境影响，非固定式调

55、控是受环境影响的调控，与DNA序列无关。 大肠杆菌DNA复制时冈崎片段之前的RNA引物是由dnaG基因编码并由引物酶催化合成的，细胞对这种酶的需求是不大，若引物酶过多还将导致细胞死亡，已知dnaG和rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上都大不相同，每个细胞dnaG产物50拷贝，而rpoD为2800拷贝，rpsU则高达40000拷贝之多，细胞通过翻译调控，解决了这个问题。 研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子，也就是说这些密码子在其他基因中利用频率很低，而在dnaG中却很高。分别计算大肠杆菌中25种非调节蛋白和dnaG和rpoD序列中64种密码子的利用频率，可以看出dnaG与其他两类有明显不同。 许多调控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在细胞内含量也很低，编码