细胞冻存复苏传代转染

1、细胞培养系列方法实验前准备】(1)实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS容液。( 2)清洁超净工作台面，照紫外 30 分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。细胞的冻存与复苏实验用品】1)2)材料：培养的贴壁细胞( 70%-80%融合)、于液氮中冻存的细胞试剂：PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DME培养基、胎牛血清、二甲亚砜(DMS)双抗 设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、 酒精灯、水浴锅、 CO2 培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作 台。试剂配制：(1)完全培养基含90%DME培养液加1

2、0%勺胎牛血清加1%勺双抗。(2) 冻存液含80%勺DME培养基加10%勺胎牛血清加10%勺DMSO用吸管混匀，置于4C冰箱中备用。细胞勺冻存(1)依照传代勺方法用 0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期勺单层细胞进行消化。(2) 收集消化细胞于离心管中， 800-1000r/min 离心 5min。(3) 弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为675*10 -1*10 个/ml。(4) 每个冻存管分装细胞悬液 1.5ml ，旋紧冻存管勺盖，并用封口膜密封。(5) 在冻存管上标明细胞勺名称、冻存时间、冻存人名等。(6) 将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4C ,0.5h

3、T-20 C,仆-80 C,过夜7转入液氮灌中。细胞勺复苏(1)准备水浴锅，调温度至38C。打开离心机。(2)用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38C水浴锅中,不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。3)用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。4)将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加 10倍体积的DME培养基,吹打混匀。1500r/min 离心4min,弃上清液。7)加入培养液吹打沉淀的细胞,使其悬浮,对细胞进行计数。按5*105个/ml的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养。24h 后取出培养瓶，观察细胞生长状况。注意事项】8)1)对数期的细胞增值能力强, 冻存后生

4、存率较高, 因此,在进行细胞冻存时,应尽量选择处于此期的细胞加以冻存。为了保证复苏后细胞的存活率, 复苏接种时, 细胞的浓度不能太低, 最好控制在5*106-1*10 7个/ml，这样才能保证复苏成功。3)冻存管的瓶盖应封盖严密,以免复苏时细胞外溢。4)同时,一次复苏的冻存管数量不要太多,否则会引起水复苏时，从液氮取出冻存管到水浴中融化的过程要快， 否则会导致冰晶的 形成，伤害细胞。浴锅中传热不佳,为防止液氮冻伤,延缓冻存的细胞悬液融化的时间。注意戴上防护手套。实验结果及分析】经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。 复苏成功的细胞24h左右可贴壁,48h 后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞

5、，将继续悬浮于培养液中，不能 贴壁。细胞的传代培养实验用品】材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞 试剂：PBS液、DME培养基(含10%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶消化液 设备： 25ml 培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置 显微镜、超净工作台、C02培养箱实验方案】1. 贴壁细胞的传代培养1)用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。2)向瓶内加入适量的PBS液，轻轻摇动后倒掉。每25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml,消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，置于37C的培养箱环境中。轻轻摇动培养瓶,在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、

6、细胞间隙增大时，迅速将消化液吸出。4)加入PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出, 加入含血清的培养液终止消化。5)用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位 应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。6)将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。7)收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心5-8min，去除上清。 细胞计数，按照 1*105-1*10 6个细胞的密度接种细胞于新

7、培养瓶中。2. 悬浮细胞的传代1) 将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。(2) 800-1000r/min 离心 5min,去除上清液。3) 加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按 1:2 或1:3 的比例分别接种于新的培养瓶中。注意事项】1) 消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。 当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时， 应终止消化。 因上皮样细胞彼此间连 接较为紧密， 其消化时的时间通常比成纤维细胞长。 此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。2) 首次传代的细胞因需适应新的环境， 可适当增加

8、其接种量， 以促进生存与增殖。3） 在对细胞进行吹打时，不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。4） 传代培养的过程通常较长， 细胞被污染的可能增加， 因此，必须严格进行无菌操作。实验结果及分析】用倒置显微镜观察可见接种 24h 后，大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部， 有少数细胞悬浮于培养基中。48h以后，细胞开始增殖、细胞的数量增多，在接种 的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出， 这些细胞内含物少而较为透明， 胞体轮廓通常较浅。 96h 以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清 晰、可见。细胞转染实验用品】细胞、6孔板、血清、培养基 DMEMOPTI-MEMGSK-3/wt 的

9、质粒、Lipofectamine2000、GSK-3/wt的质粒、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS （磷酸盐缓冲1. 细胞的准备实验前一天，将细胞接种入6孔板中，每孔中培养基的体积为1ml，细胞环境控制在37C、5%COe养箱中培养24小时。待细胞达到90%度时，准备转染，在 转染前一晚换新鲜的有血清培养基，使细胞状态良好。2.转染GSK-3/wt的质粒准备无血清培养基DMEM 0PTI-MEM转染试剂Lipofectamine2000 。（2） 转染前一小时弃去培养板中的旧培养基，换预先预热的无血清培养基。 根据Lip-2000转染说明书算出所需要的Lip-2000的体积，

10、根据各转染质粒的 浓度算出各自所需体积见表 2。表2所用质粒和转染试剂的量esselSurfaceAreaP erWell(cm2)RelativesurfaceArea(vs.24well)VolumeofPlat ingMediumDNA(ug)a ndDilutio nVolume(ul)Lip ofectami ne2000(ul)An dDilutio nVolume(ul)1052ml4.0ugi n250ul10uli n250ul(4) 将质粒加入0PTI-MEM轻轻混匀。 将Lipofectamine2000加入OPTI-MEI后轻轻混匀后，并计时孵育5分钟。将质粒加入Lip

11、ofectamine2000中，轻轻混匀后，计时孵育20分钟。(7) 20分钟后缓慢将Lipofectamine2000-质粒混合物加入培养孔中。(8)37 C、5%CO&养箱中培养24-48小时。(9)提取细胞蛋白。注意事项(1)(4)传代细胞的准备细胞在转染前 24h传代，待细胞密度达90%度时即可进行转染。如果转染前细胞生长不足12h,细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。用Lipofectin转染时，不要用聚丙烯试管，因为Lipofectin中的阳离子脂类会与聚丙烯发生非特异结合，而影响转染结果。在添加DNA脂质体混合液前，用无血清培养液充分洗涤转染细胞很重要,因为血清会强力抑制转染；有些胞外基质复合物，如硫酸蛋白聚糖，也可抑制转染。GFP表达的影响因素主要与转染时的温度、PH值和观察时间有关。同一表达载体转染同一种细胞后，分别在 33C和37C条件下培养，则33C条件 下培养者可观察到较强的荧光，而37 C条件下培养者荧光较弱