膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取

1、第27卷第4期2002年10月动物分类学报AC TA ZOO TAXONOMICA SIN ICA Vol.27,No.4Oct .,20023国家自然科学基金资助项目(编号39970099.收稿日期:20020402,修订日期:20020420.672膜翅目昆虫干标本的基因组DNA 提取3朴美花陈学新何俊华(浙江大学应用昆虫学研究所杭州310029摘要提出了膜翅目昆虫干标本基因组DNA 的提取方法,通过对实验结果和所测得的基因片段(28S D 2rDNA 的分析,表明该方法可行。关键词基因组DNA ,膜翅目,干标本,提取.中图分类号Q 966近年来,昆虫分子系统学和进化研究迅猛发展,对昆虫分

2、子系统发育中常利用的分子标记如mtDNA 和rDNA 的测序要求快速有效,因此昆虫中有效基因组DNA 的提取是重要的前提。许多研究者介绍的基因组DNA 的提取方法中所采用的材料基本上是新鲜样品或超低温冷冻标本(Blin &Staff ord ,1976;Bowtell ,1987;Gross 2Bellardd et al.,1972;Kupiec et al.,1987;王文和施立明,1993,但是分子系统发育和进化研究中经常出现所研究的类群,特别是稀有类群难以得到新鲜材料的问题,因此往往需要利用自然博物馆或标本馆的干标本提取基因组DNA ,但干标本保存时间越长基因组DNA 的降解也

3、越严重。因此,如何从干标本中提取基因组DNA 的方法对系统发育和进化研究至关重要。本文结合膜翅目寄生性种类分子系统发育研究,对干标本中的基因组DNA 的提取方法进行了探索。1材料和方法1.1材料浙江大学应用昆虫学研究所标本馆里保存的分别采于1987年(山东济南,2头、1980年(浙江奉化,2头、1954年(湖南东安,2头及1935年(江苏宜兴,2头的松毛虫脊茧蜂Aleiodes esenbecki Hartig (膜翅目:茧蜂科:内茧蜂亚科干标本。每次DNA 提取使用较完整的1头松毛虫内茧蜂胸腹部及足,重复进行2次。本实验所采用的松毛虫脊茧蜂标本,采集时用KCN 毒死,阴干后制标本,一直保存在

4、密封、控制湿度的标本馆里,因此采集及保存条件几乎完全一致。112设备PCR 仪(TECHN E FPRO G 05D ,电泳仪(大连J M 2250,台式高速冷冻离心机(SI GMA D 237520,恒温金属浴(大和CHB 2100,微波炉(GALAN Z ,匀浆器,紫外透射仪(TANON UV 2000,数码相机及其附件(KODA K DC 120,紫外分光光度仪(PER KIN EL M ER MBA 2000。113基因组DNA 提取常规DNA 提取方法(Gross 2Bellard 等,1972通常是:取虫体碾碎在37下用Pro K 培育1h 乙酸钠/ETO H 沉淀溶于50ml M

5、illiQ H 2O -20保存。实践表明:常规方法只适用于从新鲜标本中提取基因组DNA ,而对干标本却不能获得成功。为了从干标本中提取基因组DNA ,笔者摸索了一套新方法,即在利用常规方法之前,进行比较关键性的处理。具体步骤如下:图1基因组DNA 的凝胶电泳图谱(Gel electrop horesis pattern of genome DNA collected f rom dried specimens of Aleidesesenbecki 11采于1987年(in 198721采于1980年(in198031采于1954年(in 195441采于1935年(in 1935(2用冲洗

6、缓冲液(10mmol/L Tris Cl p H 810,100mmol/L NaCl ,1mmol/L MgCl 2冲洗23次;(3将虫体(1头昆虫的胸腹部及足磨成粉末;(4加入分离缓冲液(10mmol/L Tris Cl p H 8.0,10mmol/L ED TA ,1%SDS ;(5再加入蛋白酶K ,37水中1h ;(6加入5mol/L NaCl 混匀,5000g 离心数秒;(7等体积酚氯仿异戊醇(25241反复抽提直到在界面上看不到蛋白质;(8加入1/10体积3mol/L NaAc (p H 512,再加入2倍体积的冰冷的100%乙醇,-20冰箱中放置015110h ;(950l M

7、illiQ H 2O 溶解DNA 。114PCR 反应反应体系为:50l 体积,包括500ng 以上的模板DNA ,015l 215U Taq 酶(Promega ,5l 10×buffer ,4l 25mmol/L MgCl 2,1l 20mol/L Primers ,5l 2mmol/L dN TPs (Promega 。引物:引用Dowton &Austin (1998所采用的引物:扩增28S D 2rDNA 片段的PCR 条件:94变性3min 30循环(94变性30s 54,退火1min 72延伸1min 72延伸8min ,获得的28S D 2rD 2NA 片段长

8、度为475bp 。从反应混合液中取出8l 扩增产物用118%琼脂糖凝胶(上海东海制药厂进行电泳分析。2结果与分析211不同保存时间干标本中提取的基因组DNA 电泳结果图1中,采用本文3中叙述的干标本基因组DNA 的提取方法提取了基因组DNA ,可以看到1和2有较亮3764期朴美花等:膜翅目昆虫干标本的基因组DNA 提取的带,而3和4很难看到亮带,说明采于1987年和1980年的松毛虫脊茧蜂干标本中提取的基因组DNA量较高,而采于1954年和1935年的松毛虫脊茧蜂干标本中抽提的基因组DNA量极少。212用紫外分光光度计测得的OD值表1不同保存时间干标本提取物的OD值(Op tical de n

9、sit y of drie d sp eci me ns of DNA af te r diff e re nt le ngt hs of p rese rvation保存时间14年(采于1987年21年(采于1980年47年(采于1954年66年(采于1935年表1中,看到采于1987年的松毛虫脊茧蜂干标本的基因组DNA得率最高,为312ng/l,采于1935年的松毛虫脊茧蜂干标本的基因组DNA得率最低,为015ng/l,表明保存时间长基因组DNA得率明显下降。213新鲜标本和干标本的基因组DNA扩增图2中,利用新鲜标本基因组DNA提取方法抽提干标本基因组DNA,然后进行28S D2 rDN

10、A片段的PCR扩增反应,可以看到3有亮带,而1和2无亮带。说明新鲜标本的基因组DNA提取方法不适合于干标本基因组DNA的抽提。因此探索了干标本中基因组DNA提取方法。214不同保存时间干标本的DNA扩增图3中,基因组DNA提取方法采用了本文中叙述的干标本DNA的提取方法,然后进行28S D2rDNA片段的PCR扩增反应,可以看到1和2有亮带,3和4无亮带。说明采于1987年和1980年的松毛虫脊茧蜂干标本中抽提的基因组DNA的PCR扩增得到成功,但采于1954年和1935年的松毛虫脊茧蜂干标本的实验失败,失败原因可能是采于1954年和1935年干标本中没有完整的基因组DNA。3讨论通过实验总结

11、出了从干标本中提取基因组DNA的非常关键的处理措施。首先,在S TE 缓冲液中浸渍干标本数小时,然后再用冲洗缓冲液冲洗23次,这是从干标本中提取基因组DNA的重要环节。因为长时间保存在标本馆或博物馆里的干标本中,基因组DNA的降解严重并且存在影响PCR扩增的因素,所以此方法在基因组DNA提取中大大减少基因组DNA的机械断裂和其它阻断剂,有利于保护干标本基因组DNA,减轻或排除对PCR扩增反应的影响。依此方法对采于1980年和1987年的松毛虫脊茧蜂干标本进行了实验,基因组DNA的提取、PCR扩增及测序均获得了成功,而对采于1935年和1954年的干标本的上述实验均未获得成功,表明该方法适于对2

12、0年以内的干标本的基因组DNA的提取。本研究工作对分子系统学和进化研究将具有重要意义,能够充分利用标本室历年来积累的标本,缩短研究时间,节省人力和物力。476动物分类学报27卷 图3不同保存时间干标本DNA 的PCR 扩增产物(28S D 2rDNA 片段的凝胶电泳图谱(The gel electrop horesis pattern of PCR amplification p roduct (28S D 2rDNA gene f ragment of dried speci 2mens of DNA of after different lengths of p reseration ti

13、me ,collected f rom Aleiodes esenbecki 1.采于1987年(in 19872.采于1980年(in 19803.采于1954年(in 19544.采于1935年(in 1935M 标准分子量(marker 图2新鲜标本和干标本DNA 的PCR 扩增产物(28S D 2rDNA 片段的凝胶电泳图谱(The gel electrop horesis pattern of the PCRamplification p roduct (28S D 2rDNA genef ragment of f resh and dried specimens of DNA 1.

14、采于1987年的松毛虫脊茧蜂干标本(Aleiodes microc 2ulat us dried specimens collected in 19872.采于1980年的松毛虫脊茧蜂干标本(Aleiodes esenbecki dried speci 2mens collected in 19803.采于2000年的黑脊茧蜂新鲜标本(Aleiodes esenbecki f resh specimens collected in2000M 标准分子量(marker 参Biochem ,36:32.王文,施立明,1993.一种改进的动物线立体DNA 提取方法.动物学研究,14(2:197198

15、5764期朴美花等:膜翅目昆虫干标本的基因组DNA 提取676动物分类学报27卷EX T RAC TIO N O F GEN O M E DNA FRO M D RI ED S P ECIM ENS O F H YM EN O P T ERAN INS EC TS(INS EC TAPIAO Mei2HuaCHEN Xue2XinHE J un2Hua(Instit ute of Applied Entomology,Zhejia ng University,Ha ngzhou310029,Chi naA bs t r actAn effective method of extracting

16、genome DNA f rom dried specimens is important f or the study of molecular p hylogenitics and evolution in insects.This paper deals with methods of ex2 tracting genome DNA f rom dried specimens of Hymenoptera,using PCR apparatus to amplif y and sequence the28S D2rDNA gene segment.DNA extraction was d

17、one as f ollows:soaking of material in S TE buffer f or5h,washing223times with10mmol/L TrisCl(p H810,100mmol/ L NaCl,1mmol/L MgCl2,grinding,addition of600l10mmol/L TrisCl(p H8.0+10mmol/ L ED TA+1%SDS+100g of Proteinase K heated to37f or1h.The homogenate was ex2 tracted with p henol and the genome DN

18、A p recipitated with2volumes of ethanol.DNA was redis2 olved in50l of sterile water and stored at-20.PCRs were carried out in50l volumes con2 taining015l DNA extracts,2.5U Boehringer Taq polymerase,5.0l Boehringer Taq buffer, 2mmol/L dN TPs,16mol/L p rimer(adopted Dowton and Austin(1998p rimersand25

19、 mmol/L MgCl2.Cycling conditions were thirty cycles of94denaturation(30s,54anneal2 ing(1minand72extension(1min,with an initial denaturation of3min at94and a final extension of72f or8min.The result shows that genome DNA couldle be successf ully extacted f rom Aleiodes esenbecki dried specimens collec