老年结直肠癌患者的肠道菌群检测结果分析

1、现代消化及介入诊疗 2012年 第 17卷 第 4期 Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.4老年结直肠癌患者的肠道菌群检测结果分析王新颖 1王中秋 1徐萍 1李丙生 1江美玲 1许岸高 1,2·短篇论著 ·【 摘要 】 目的 探讨老年结直肠癌患者的肠道菌群变化 。 方法 选取 2008年 1月至 2011年 6月老年结直肠癌患者粪 便标本 50例及正常对照标本 50例, 运用传统梯度稀释法进 行平板培养及提取粪便 DNA 后应用 SYBR Green 实时荧 光定量 PCR 反应测定 3种需氧菌和 4种厌氧

2、菌的数量以进 行菌群分析 。 结果 患者组粪便中需氧菌与厌氧菌菌群数与 正常对照组比较均有明显改变 。 需氧菌中患者组金黄色葡萄 球菌明显增加 (P <0.05 。 厌氧菌中患者组双歧杆菌和乳酸 杆菌均有程度不同的减少 (P <0.05 , 在 70岁以上老年患者 中减少更明显; 拟杆菌明显增加 (P <0.01 , 在 70岁以上老 年患者中减少更明显 。 肠杆菌 、 肠球菌 、 小梭菌数量无明显差 别 (P >0.05 。 平板培养法与定量 PCR 法结果一致, PCR 法 较平板培养法更敏感 。 结论 老年结直肠癌患者存在肠道菌 群紊乱, 其粪便中双歧杆菌及乳酸杆

3、菌数量较正常对照明显 减少, 金黄色葡萄球菌和拟杆菌数量明显增多, 随年龄增加 菌群紊乱程度更严重, 提示老年结直肠癌的发生 、 发展与肠 道菌群有一定关系, 针对性的补充益生菌可能是缓解病情的 有效方法 。【 关键词 】 老年; 结直肠癌; 肠道菌群; 平板培养; 实时荧 光定量 PCR结直肠癌是常见的恶性肿瘤, 其发病率居我国恶性肿瘤 第三位, 随着生活水平的提高 、 生活习惯的改变, 其发病率逐 年增加 1。 老年人是结直肠癌的高发人群, 随着年龄增长, 结 直肠癌发病的危险性增加 。 在发达国家, 90%以上病例在 50岁以上, 英国发病高峰年龄为 70岁, 5%10%为 80岁 2,

4、 美 国发病高峰为 75岁, 40岁以下发病少于 6%3。 我国结直肠 癌发病同样具有老年化趋向 。 上海中位发病年龄为 61岁, 广 州结肠癌中位发病年龄为 66岁,直肠癌为 65岁 4。 目前结直 肠癌的病因尚未完全清楚,感染是否是结直肠癌的促发因 素, 目前尚未被证实, 已有研究提出结肠细菌产生的过氧化 物可促发癌症 5。 但老年结直肠癌发病与肠道菌群紊乱是否 存在相关性目前尚无文献报道 。 因此, 研究老年结直肠癌患 者肠道菌群状况, 可以为该病在老年人群中的发病机理提出 佐证, 并为制定治疗和预后评估方案提供参考 。 本研究选取 南方医院 20082011年确诊的老年结直肠癌患者 5

5、0例作为研究对象, 旨在探讨其肠道菌群的变化情况 。对象与方法一 、 研究对象经我院结肠镜下取材行病理检查诊断证实为结肠癌的 50例老年结直肠癌患者,按中华老年医学学会建议, 取 60岁 以上患者, 其中男 36例, 女 14例, 平均年龄 67岁 (6082岁 , 划分为:6069岁 、 7079岁 、 80岁以上; 确诊时均为晚 期, 于治疗前取样, 取样前 4周内均未应用抗生素或微生态 制剂 。 相应时间段内取正常对照 50例, 其中男 32例, 女 18例, 平均年龄 61.5岁 (6081岁 , 所有正常对照者均无消化 道慢性疾病史, 常规体检及粪便常规检查均未见异常, 留取 粪便标

6、本前 4周内均未应用抗生素或微生态制剂 。 2组的年 龄及性别构成差异均无统计学意义 (P >0.05 。二 、 研究方法采用平板培养法及 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 法检测粪便菌群中 3种需氧菌群 (肠杆菌 、 肠球菌 、 葡萄球 菌 和 4种厌氧菌群 (拟杆菌 、 双歧杆菌 、 乳酸杆菌 、 小梭菌 的变化 。1. 平板培养法采用日本光岗知足方法,取新鲜粪便标本 0.5g 置于含 有 4.5ml 稀释液 (加有 45粒玻璃珠 小瓶中, 置旋涡混合 器 (300r/min 震荡 1min ; 另取 7只无菌青霉素小瓶, 每瓶加 稀释液 1.8ml 。 从首只小瓶中取 0

7、.2ml 混悬液至第二个小瓶 中震荡混匀, 依次稀释, 按稀释度分别为 10-2、 10-3、 10-8。 稀 释后的标本接种于培养基, 每个平板 3个稀释度 。 需氧菌置 37 温箱 24h 后后观察结果,厌氧菌置 37 厌氧培养箱 72h 后观察结果计数,再转换为 cfu/g粪便 。 菌落计数经涂片 、 革 兰染色 、 生化鉴定, 必要时使用气相色谱检测细菌代谢产物, 确认为该菌 。2. SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 法 (1反应引物的设计与合成 肠杆菌参照 Anderson B 等报道 6, 肠球菌 、 金黄色葡萄 球菌 、 双歧杆菌 、 乳酸杆菌 、 小梭菌参照 Ma

8、tsuda K 等报道 7, 拟杆菌根据其 cfxA 基因系列设计引物 。 8对引物用 Blast 进 行在线核实其特异性后,由上海英骏生物技术有限公司合 成 。 引物系列见表 1。(2 粪便 DNA 提取及 PCR 反应取样后称取中段大便, 每份 300mg , 按粪便细菌基因组 DNA 提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司 说明提 取粪便细菌 DNA , -20 保存备用 。提取的 DNA 分别进行 7作者单位:1510515南方医科大学南方医院消化内科;2516003惠州市医学研究所通讯作者:许岸高, E-mail :mrangao基金项目:惠州市科技计划项目 (NO :2010Y0

9、61226-现代消化及介入诊疗 2012年 第 17卷 第 4期 Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.4表 1细菌的 PCR 扩增引物系列种细菌的 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 反应, 反应体系:Real Master Mix :9l , 上 、 下游引物各 1l 、 模板 DNA 2l 、 DEPC 水 7l 、加石蜡油 8l , 反应体积为 20l 。 反应条件 :95 预变性 2min ;95 变性 20s ; 肠杆菌 59 , 肠球菌 、 金 黄色葡萄球菌 60 , 拟杆菌 57 , 双歧杆菌 57

10、, 乳酸杆菌 58 , 小梭菌 59 退火 30s , 68 延伸 30s , 循环 40次; 74 后延伸 30s 。每次实验同时设标准品校正和阴性对照, 反应 完毕后根据溶解曲线分析 PCR 产物的特异性,并由 Light Cycler PCR 仪分析定量结果 。 结果以细菌拷贝数的常用对数 /g 粪便表示 。(3 标准曲线的制作取粪便基因组 DNA 用肠杆菌 、 肠球菌 、 金黄色葡萄球 菌 、 双歧杆菌 、 乳酸杆菌 、 拟杆菌和小梭菌引物进行特异性扩 增, 将出现目的条带的扩增产物按 DNA 产物纯化试剂盒 (购 自北京艾德莱生物科技有限公司 说明进行纯化, 纯化产物 用核酸蛋白检测

11、仪 Biophotmeter 测定 OD 值及浓度, 换算为 各标准品 1l 的拷贝数 (肠杆菌 5.84×1014、 肠球菌 2.57×1014、金黄色葡萄球菌 3.55×1014、 拟杆菌 3.95×1014、 双歧杆 菌 3.55×1014、 乳酸杆菌 4.57×1014、 小梭菌 2.02×1014 用于 制作标准曲线 。 将各纯化产物 10倍稀释后作为标准品进行 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 反应 。 根据读取的荧光数 据, 由系统软件自动分析循环阈值 (Cycle thresho ld, Ct ,

12、并 生成标准曲线 。三 、 统计学分析结果以 ±s 表示, 应用 SPSS13.0软件进行数据分析, 采 用 t 检验进行分析,以 P <0.05判定有显著性差异 。 结果一 、 平板培养法菌落计数结果患者组粪便中需氧菌与厌氧菌菌群数与正常对照组比 较均有明显改变 (P <0.05 。 需氧菌中患者组金黄色葡萄球 菌明显增加 (P <0.05 , 厌氧菌中患者组乳酸杆菌和双歧杆 菌均有程度不同的减少 (P <0.05 ,拟杆菌明显增加 (P <0.01, 在 70岁以上老年患者中减少更明显 。 肠杆菌 、 肠球菌 、 小梭菌数量无明显差别 (P >

13、0.05 , 见表 2。二 、 细菌 PCR 定量检测结果细菌名称靶基因扩增片段长度 (bp 引物序列 (5 -3肠杆菌 16S rRNA 75F:5 -CTC GCT GGC ATT TGC GTA G-3 R:5 -ATC TTT TGC CGT CCG TTT TGC-3 肠球菌 ddl 215F:5 -TTG GCA TTC CAC AAG TAC CA-3 R:5 -AAT TGC TCG GGC ATC ATA AC-3 金黄色葡萄球菌 ddl 186F:5 -TCG GAC GAC TTT GCC TCC CG-3 R:5 -TCG CAC CGG CTC AAT CCG C-3

14、拟杆菌 cfxA 169F:5 -TGA CAG TGA GAG ATT TGC TGC TGC GTT-3 R:5 -TCA GCC GAC ATT TCC TCT TCC GT-3 双歧杆菌 cpn60200F:5 -TAC TTC GTC ACC AAC GCT GA-3 R:5 -CCA CGG ATG TTG TTC AGG AT-3 乳酸杆菌 16S rRNA 124F:5 -CAC CTT CCT CCG GTT TGT CA-3 R:5 -CGA GCG CAA CCC TTA TTA TCA-3 小梭菌rrnA-16S260F:5 -TGA AAG ATG GCA TCA T

15、TC AAC-3 R:5 -GGT ACC GTC ATT ATC TTC CCC AAA-3表 2粪便标本平板培养结果 (logN ±s菌属6069岁7079岁80岁以上患者正常对照患者正常对照患者正常对照7.03±0.408.77±0.267.62±0.3510.24±1.22*7.98±0.489.76±1.3410.06±2.977.83±0.909.44±0.705.25±0.877.41±0.99注:与相应年龄段正常对照组比较, *P <0.05, *P &

16、lt;0.01。227-现代消化及介入诊疗 2012年 第 17卷 第 4期 Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.45.60±0.175.30±0.294.06±0.704.93±1.014.89±0.125.15±0.67菌属 6069岁7079岁80岁以上患者组粪便中双歧杆菌及乳酸杆菌数量与正常对照组 比较明显减少 (P <0.01 , 肠杆菌 、 金黄色葡萄球菌 、 拟杆菌 明显增加 (P <0.05或 0.01 , 在 70岁以上老年患者中改变更

17、明显, 肠球菌 、 小梭菌数量无明显差别 (P >0.05 。 见表 3。讨论结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤, 其发病率随着我国人 口老龄化有增高趋势 8。 肠道中细菌的组成 、 数量及活性在维 持人体健康中起重要作用 9。 正常情况下肠道内含有大量细菌, 其中厌氧菌占 99%, 需氧菌仅占 1%, 主要成员为双歧杆 菌 、 拟杆菌 、 乳杆菌 、 梭菌 、 肠杆菌 、 肠球菌 、 葡萄球菌 、 消化球 菌 、 真杆菌 、 韦荣氏球菌 、 链球菌及酵母菌等, 被称为正常菌 群 。 生理情况下,肠道菌群与宿主处于相对平衡状态, 参与机 体对食物消化和吸收, 能够增强机体的免疫力, 对机体起到

18、 保护作用 10; 如果正常菌群失调, 可引起多种疾病发生, 可能 与衰老和肿瘤的发生有关 。 但肠道感染或肠道微生态失调是 否是结直肠癌的促发因素, 目前尚未被证实, 但已有研究提 出结肠细菌产生的过氧化物可促发癌症 11,12。 同时有研究显 示:结直肠癌患者肠道菌群出现微生态失调, 可能与其发生 、 发展有关, 主要表现为结直癌患者粪便中厌氧菌与需氧菌的 比值下降, 通常以双歧杆菌 /大肠杆菌 (B/E 的比值作为评估 指标 。 双歧杆菌的减少会导致机体抗肿瘤免疫力下降, 使肿 瘤细胞逃离机体免疫监控的机会增大 13。 Tannock 等 14研究也证明类杆菌 、 梭杆菌及梭状芽胞杆菌在

19、肠道内增多有致癌 作用, 这些细菌通过产生致癌物质 、 辅致癌物质或前致癌物 质而导致癌症的发生 。 因此对肠道细菌变化的研究, 对于了 解细菌在结直肠癌发病中的作用, 寻找结直肠癌最佳治疗方 法有重要意义 。基于以上考虑, 本研究主要选取了肠道菌群中 3种需氧 菌群 (肠杆菌 、 肠球菌 、 葡萄球菌 和 4种厌氧菌群 (拟杆菌 、 双歧杆菌 、 乳酸杆菌 、 小梭菌 , 检测老年结直肠癌患者的肠 道菌群状况, 结果显示老年结直肠癌患者粪便中双歧杆菌及 乳酸杆菌数量明显减少, 以双歧杆菌属减少为甚; 金黄色葡 萄球菌 、 拟杆菌数量明显增加, 且随年龄增加, 变化更加明 显, 高龄老人减少最

20、严重, 提示老年结直肠癌患者肠道菌群 出现微生态失调, 且与年龄具有相关性 。 我们同时利用传统 细菌培养法和分子生物学技术 16SrRNA 法定量检测患者粪 便菌群, 二者结果一致 。 后者能够实现对双歧杆菌属 、 乳酸杆菌属等难培养的肠道细菌的定量分析, 具有更省时 、 省力 、 准 确及高灵敏度的特点, 结果显示老年结直肠癌患者与正常对 照者间细菌数量的差异有统计学意义 (P <0.05 , 并与年龄 相关, 提示肠道菌群的变化与结直肠癌的发生及发展机理有 一定关系 。 同时说明 SYBR Green 荧光定量 PCR 技术为研 究老年结直肠癌患者肠道菌群组成 、 动态变化及相关的

21、研究 提供了一种有效检测手段, 为临床诊治提供新的理论依据 。参考文献1Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA Can -cer J Clin, 2012,62:10-29.2Ballard-Barbash R, Friedenreich CM, Courneya KS, et al. Physicalactivity, biomarkers, and disease outcomes in cancer survivors:a systematic review.J Natl Cancer Inst, 2012

22、,104:815-840.3Morikawa T, Kuchiba A, Qian ZR, et al. Prognostic significance andmolecular associations of tumor growth pattern in colorectal cancer. Ann Surg Oncol, 2012,19:1944-1953.4曹卡加 , 马国胜 , 刘奕龙 , 等 . 广州市 2000-2002年大肠癌的发病 率分析 . 癌症 , 2009,28:441.5Wang X, Huycke MM. Extracellular superoxide produ

23、ction by Ente -rococcus faecalis promotes chromosomal instability in mammalian cells. Gastroenterology, 2007,132:551-561.6Anderson B, Rashid MH, Carter C, et al. Enumeration of bacterio -phage particles:Comparative analysis of the traditional plaque assay and real -time QPCR-and nanosight -based ass

24、ays. Bacteriophage, 2011,1:86-93.7Matsuda K, Tsuji H, Asahara T. Establishment of an analytical sys -tem for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol, 2009,75:1961-1969.8刘国伟 , 蔡全才 . 大肠癌筛查现状及早期诊断进展 . 现代肿瘤

25、医 学 , 2009,17:770-774.9Festi D, Schiumerini R, Birtolo C, et al. Gut microbiota and itspathophysiology in disease paradigms. Dig Dis, 2011,29:518-524.10Madden JA, Hunter JO. A review of the role of the gut microflora inirritable bowel syndrome and the effects of probioties. Br J Nutr, 2006,88(Suppl1

26、:s67-s72.11Zhu Y. Gut microbiota and probiotics in colon tumorigenesis. Can -cer Lett. 2011,309:119-127.12Stanghellini V.Gut microbiota and related diseases:clinical features.Intern Emerg Med, 2010,5(Suppl1:S57-63.表 3粪便标本细菌定量 PCR 检测结果 (logN ±s注:与相应年龄段正常对照组比较, *P <0.05, *P <0.01。 228-现代消化及

27、介入诊疗 2012年 第 17卷 第 4期 Modern Digestion &Intervention 2012, Vol.17, No.4肝癌伴动静脉瘘的造影表现黄永东张振岳毛 健皇甫风华蔡晓晴·短篇论著 ·作者单位:226200江苏省启东市人民医院介入科【 摘要 】 目的 熟悉肝癌伴动静脉瘘的造影表现,提高动 静脉瘘的识别能力 。 方法 选取 30例原发性肝癌病例, 通过 DSA 造影表现来明确是否合并动静脉瘘,并且确定动静脉瘘 的分型 。 结果 本组 30例原发性肝癌并 AVS 患者中肝动脉 -门静脉瘘 25例; 肝动脉 -肝静脉瘘 3例; 肝动脉同时合并肝

28、 静脉及门静脉瘘 2例 。 结论 通过肝总动脉造影, 于动脉期见 到门静脉或 /和肝静脉显影即可明确原发性肝癌是否伴有动 静脉瘘 (AVS 的存在 。【 关键词 】 肝癌; 动静脉瘘; 造影表现启东是原发性肝癌的高发地区 。 原发性肝癌的治疗方法 首选手术切除, 对于不能手术的中晚期肝癌 、 术后复发的患 者, 目前最有效的方法是介入治疗 。 而肝癌伴动静脉瘘的介 入治疗是肝癌介入治疗的难点 1。 如果不能正确识别肝癌伴 动静脉瘘, 不仅介入疗效差, 而且可能导致严重的并发症 。 因 此正确识别肝癌伴动静脉瘘的造影表现并选择相应的介入 方案才能保证其疗效 2。 作者结合多年的临床工作经验, 拟

29、具 体描述肝癌伴动静脉瘘的造影表现, 以供参考 。材料与方法一 、 材料本组男性 24例, 女性 6例; 年龄 3275岁, 平均年龄 51岁 。 术前经 B 超 、 CT 、 MRI 、 AFP 及部分患者的手术病理证实 为原发性肝癌, 本组病例均符合肝癌诊断标准, 临床 Child-Pugh 评分 A-B 级, 无介入治疗禁忌证, 所有的造影表现均伴 有门静脉或 /和肝静脉瘘 。二 、 方法所用机器为 Siemens 公司的 AXIOM Artis FA 血管造影 机 。 高压注射器使用的是 LF 的 ANGIOMAT 6000。 术前行碘 过敏试验 。 采用 Seldinger 技术经皮

30、股动脉穿刺置管 。 常规行 腹腔干 、 肠系膜上动脉 、 肝总动脉造影, 对比剂为碘海醇 (300mgI/ml。 腹腔干造影总量 8ml , 注射速度 5ml/s, 压力 300PSI ,观察血管解剖 ; 肠系膜上动脉造影, 总量 15ml , 注射速 度 5ml/s, 压力 300PSI , 了解有无变异的肝动脉 、 间接观察门 静脉血流情况; 肝总动脉造影, 总量 16ml , 注射速度 4ml/s, 压力 300PSI , 明确肿瘤染色及判断有无动静脉瘘 。三 、 诊断判断原发性肝癌是否存在动 -静脉瘘,笔者认为通过肝 总动脉造影, 于动脉期见到门静脉或 /和肝静脉显影即可明确 动静脉瘘 (AVS 的存在, 本组 30例原发性肝癌并 A