禽流感病毒中和实验整理

1、禽流感病毒中和实验及其他方法（一）实验材料1、中和反应实验材料（1）病毒：一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（ TCID50）的滴定（2）血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56 30 分钟灭活，动物血清需 RDE处理。 20储存，避免多次反复冻融。（3）MDCK细胞和细胞培养试剂1）MDCK细胞（狗肾上皮细胞）2）MDCK细胞培养液： DMEM+5牛%血清 +抗生素，过滤除菌500 毫升 DMEM（修饰的 Eagles 培养基）5.5 毫升 100 ×抗生素（ 100单位/毫升青霉素 +100微克/毫升链霉素）5.5 毫升 100 

2、15;LGlutamine （2 毫摩尔）25.5 毫升 56 、30 分钟加热灭活的牛血清3）胰酶 / EDTA（4）其它1) 平底 96 孔微量培养板2) 病毒稀释液： DMEM+1牛%血清白蛋白 +抗生素，即配即用429 毫升 DMEM66 毫升 7.5% 牛血清白蛋白( BSA)5 毫升 100 ×抗生素3) TPCK胰酶(使用浓度为 2 微克/毫升)4) 固定液： 80%的丙酮，即配即用， 4保存400 毫升 丙酮100 毫升 PBS，PH 7.22、ELISA实验材料(1) 抗体 1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体(2) 抗体 2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG(3)

3、 洗涤液： PBS+0.05%TWEEN204 升 PBS ， PH 7.22毫升 TWEEN 20(4) 封闭液： PBS+1%牛血清白蛋白 +0.05 TWEEN20867毫升 PBS， PH 7.2132 毫升牛血清白蛋白1毫升 TWEEN 20（5）底物和底物溶液：常用的辣根过氧化物酶（ HRP）所用底物为磷苯二胺（ OPD）底物溶液为 PH5.0 磷酸盐柠檬酸缓冲液（ 0.05M） 底物和底物溶液： 10 毫克 OPD20 毫升柠檬酸缓冲液（含 0.015%双氧水）即配即用磷酸盐柠檬酸缓冲液， PH5.058.8 克柠檬酸三钠1 升蒸馏水用盐酸调节 PH为 5.0加 0.015%双氧

4、水，（临用前加入）* 如果使用磷酸盐柠檬酸缓冲液胶囊 （Sigma）1 个胶囊加入 100毫升 蒸馏水，临用前配制（6）终止反应液： 1N硫酸（ 28毫升浓硫酸 +1升蒸馏水）3、其他细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）备注：A.以上实验材料购自 Gibco, ，Hyclone ，Dynatech，Kirkegaard&Perry 和 Sigma 公司，材料编号（ CAT#）参照英文讲义。B. 实验材料的配制，例如 0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实 验技术一书。（二）质量控制病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗

5、血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过 程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对 照，以及对病毒使用剂量进行滴定。1、血清对照血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含 有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，20保存，并避免反复冻融使用。（1）阴性血清对照1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病 毒。3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。（2）阳

6、性血清对照1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。* 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液 RDE（即受体破坏酶） 处理，以排除非特异性反应因素。2、病毒和细胞对照每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查， 以便获得准确可靠的实验结果。（1）阳性和阴性细胞对照般设立 4 个重复孔为阳性细胞对照， 即将细胞与 100 倍组织细胞半数感染剂量（100TCID50）的病毒进行混合培养。同时设立 4 个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病 毒稀释液进行混合培养。阳性细胞对照： 50微升病毒稀释液 +50微升病毒+10

7、0微升 MDCK细胞。阴性细胞对照： 100微升病毒稀释液 +100微升 MDCK细胞（2）病毒工作液滴度检查一般第 1孔加入含有 200TCID50的 100微升病毒液，然后进行 2倍稀释，再与 MDCK 细胞进行混合培养。病毒滴度检查： 50 微升 2 倍系列稀释病毒液（第 1 孔为 100TCID50）+50微升病毒稀释液 +100微升 MDCK细胞（ 1.5 × 104细胞/ 孔）（三）实验步骤1、病毒滴度测定（组织培养半数感染量 TCID50 滴定）（1） 流感病毒制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝实验测定病毒的存在， 分装后 70冻存。（2） 病毒的稀

8、释1）取 1管冻存病毒尿囊液， 1:100 稀释（ 100微升病毒液 +9.9 毫升稀释液）2）第1排孔加入 146微升 1:100 稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成 10-2、10-2.5 、10-3、10-3.5 10-7 。每孔含 100微升病毒液，每个稀释度重复 4 孔，详细操 作参见图 1。* 人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染 MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加 入2微克/毫升的 TPCK胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下 即可感染 MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两 种稀释液，以获得最佳结果。（3）MDCK细胞的准

9、备1）使用前 2天将MDCK细胞1:100 传代，使之 7090%成片，处于对数生长期的细胞对 病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于 30 代）将使细胞对病 毒的敏感性降低。2）弃去细胞培养液，用 5 毫升胰酶 / EDTA 洗细胞一次，然后弃去。3）加4到5毫升胰酶 / EDTA 覆盖细胞（ 162cm2的细胞培养瓶） 37 5%CO2温箱中消 化 1020 分钟。4）待细胞开始脱落时，加 510毫升 MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入 离心管中，用 PBS洗 2 次，以去除牛血清。5）将细胞悬浮于病毒稀释液中，用 1 毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计

10、数细胞数量。6）用病毒稀释液将细胞稀释成 1.5 ×105细胞/ 毫升。7）加100微升细胞（ 1.5×104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。8）在37 5%CO2温箱中培养 1822小时。（4）测定组织细胞半数感染剂量（ TCID50）1）弃去微量培养板中的细胞液， 250微升 PBS洗细胞一次。2）弃去 PBS（不要让细胞干燥），加入 100微升/ 孔固定液。3）覆盖微量培养板，于室温固定细胞 10 分钟。4）弃去固定液，让微量培养板室温干燥。5）用 ELISA检测细胞感染（参见 ELISA部分）6）利用 ELISA检测仪，于 490纳米波长，测定每孔吸光度

11、（ OD）值，计数细胞阴性对照孔的平均 OD值7）若含有不同稀释度病毒孔平均 OD值是细胞阴性对照孔平均 OD值的 2倍以上，则判 断为病毒生长阳性。8）根据 Reed和 Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得 TCID50/100 微升（参见附 录和表 2）。9）在进行中和实验前，稀释病毒液，使之 50 微升中含有 100TCID50流感病毒。2、病毒微量中和实验（1）待检血清的准备和稀释1）检测对一种病毒的中和抗体需要 10 微升血清，每份血清需要进行至少 1 次重复测 定（共需至少 20微升血清 /每种病毒），每块板可检测 11份样品。2）人血清需 56加热灭活 30 分钟。3）实

12、验设计请参照图 2。4）每孔中加入 50 微升病毒稀释液。5）第 1 排中（ A1A11）再加入 40微升病毒稀释液，使之成为 90 微升/ 孔。6）加入 10微升待检血清于第 1排 A1A11。7）将待检血清作系列倍比稀释（ AH）使之成为 1:10 、1:20 、1:40 1:1280 。（2）病毒的准备1）稀释病毒至 100TCID50/50 微升。根据病毒特性选择是否在病毒稀释液中加入 TPCK 胰酶（大约 5 毫升/ 每板）。2）除细胞阴性对照孔（ 4 孔）外，每孔加入 50微升病毒工作液。3）加 50微升病毒稀释液于细胞阴性对照孔。4）选择 1列孔做病毒工作液滴度核实。第 1孔加入

13、 200TCID50/100 微升病毒工作液， 做系列倍比稀释，使之成 100TCID50，50，25，12，60.7 。然后每孔加入 50微升病毒稀释液，使体积至 100 微升 / 孔5）摇匀病毒血清混合物，放 37温箱作用 2 小时。（3）MDCK细胞的准备。（参见病毒滴定测定部分）加 100微升细胞液（1.5 × 104细胞/ 孔）于含有病毒血清混合物以及倍比稀释病 毒工作液的微量板中， 37温箱孵育 1822 小时。* 当测定大量样品时，每叠培养板一般不超过 4 5 块，各叠板之间要保持一定 距离，以确保混合物受热均匀，从而达到良好的中和效果。（4）细胞的固定1） 弃去微量培

14、养板中的细胞液。2）250 微升 PBS洗细胞一次。3）弃去 PBS（不要让细胞干燥），加入 100微升/ 孔固定液。4）覆盖微量培养板，于室温固定细胞 10 分钟。5）弃去固定液，让微量培养板室温干燥。3、酶联免疫吸附实验（ ELISA）ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物 时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应， 即形成有色的产物， 便 可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。 该方法具有特异性、 敏感性、 快速性和 简易性等优点。在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（ HRP标记的羊抗鼠 IgG 抗体）与存在于 MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原 -

15、核蛋白单克隆抗体复合物结 合， HRP酶催化 OPD，使无色底物形成橙黄色化合物，再由 ELISA 检测仪测定吸 光度值，从而获得中和抗体滴度。（1）实验操作1）用250微升 PBS洗涤微量培养板 3次，以去除残余的丙酮。2） 用封闭液 1：4000（或最佳稀释度）稀释抗体 1（抗流感病毒核蛋白 -NP单克 隆抗体）3）每孔加入稀释后的 100 微升抗体 1，室温作用 1小时。4）用 250 微升洗涤液洗板 4 次以除去抗体 1。5）用封闭液 1:2000 （或最佳稀释度）稀释抗体 2（HRP标记的羊抗鼠 IgG）。6）每孔加入稀释后的 100 微升抗体 2，室温作用 1小时。7）用 250

16、微升洗涤液洗涤板 6 次以除区抗体 2。8）每孔加 OPD底物 100微升（ 10毫升 OPD+20毫升柠檬酸缓冲液 +10微升 30%双 氧水，即用即配）。9）室温放 10 分钟左右显色，直至细胞阳性对照孔变橙黄色，而细胞阴性对照孔 尚未变色时，每孔加 1M硫酸 100 微升终止反应。10）在 ELISA测定仪上（ 490纳米）读出每孔 OD值。（2）结果判定下列公式用于判定中和反应结果（细胞阳性对照平均 OD值细胞阴性对照平均 OD值） 2+细胞阴性对照平均 OD值=XX=细胞半数感染阈值，每孔 OD值低于 X 值时，判定为中和反应阳性，中和反应 阳性的血清最高稀释度即为血清中的和抗体滴度

17、。* 在特殊情况下可用目测法判定结果， 即加底物后， 肉眼下出现橙黄色反应的 为阴性。无色为阳性。待检系列稀释血清中无色孔的最高稀释度即为血清的中和抗体 滴度。* 流感病毒中和实验的质量控制a. 阴性血清对照孔的 OD值应该与阳性细胞对照孔的 OD值无明显差别。b. 病毒工作液滴度检测孔，上数 35 孔呈阳性反应，显示正常病毒量。孔序1234567TCID50100502512631.5OD值+若超过 5 孔阳性，则为病毒过量，若少于 3 孔阳性，则为病毒量不足。c. 阴性细胞对照孔的 OD值一般小于 0.2 ，阳性细胞对照孔的 OD值一般在 1 左右d. 每次测定中，阳性血清对照的中和抗体滴

18、度应该在 2 倍之内波动。4、操作注意事项(1) 待检人血清需 5630 分钟灭活，动物血清需 RDE处理。(2) 待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。(3) 每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低， 以及细胞阳性对照 OD值过低，须对病毒进行重新滴定。(4) MDCK细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化(代数过高)。 因此，必须在 10 代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。(5) 牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒 稀释液混淆使用（6）病毒与抗血清混合，常规采用 37作用 1 小时，该实验采用 37作用 2 小时，但针

19、对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。（7）在 ELISA 过程中，每步都要洗涤，以保证结果可靠。（8）选择合适的抗体稀释浓度，一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗 体进行 ELISA 测定，以获得最佳稀释度。（9）正确控制显色时间，以降低背景染色。（10）大量测定时， 为稳定培养液的 PH值，可用 HEPES增加溶液的缓冲能力， 减少 PH变化对细胞的不利影响。（11）在缺少病毒特异性抗体的情况下， 可用细胞病变观察或测量培养板中每 孔血凝活性来替代 ELISA方法，但细胞培养时间须从 1822 小时增至 24 天。4、病毒 TCID50 滴度的计算组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用 ReedMuench方法计算。（1） 计算各病毒稀释度阳性孔数目（ 1）和阴性孔数目（ 2）（2） 计算阳性和阴性孔的累积数。阳性孔累积数由下向上累计（ 3）；阴性孔累积数由上向下累计（ 4）（3）计算阳性孔的百分比：比率（ 5）=（3）/ （3）+（4），（6）=（5） ×100（4）计算距离比例距离比例 =（大于 50%的阳性百分比 50）/ （大于 50%的阳性百分比小于 50% 的阳性百分比） =（7550）/ （750）=0.3TCID50的对