禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案

1、由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一， 也是影响中国小麦生产的重要 病害2。小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。在全世界普遍发生，气候湿润多雨的 温带地区受害比较严重， 在潮湿和半潮湿区域发生率较高。 从幼苗到抽穗都可受害， 主要 引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。小麦赤霉病的表现小麦赤霉病主要引起穗腐、 苗腐和杆腐等症状。 最常见的是穗腐。 初期在颖片和小穗 上会出现浅褐色斑， 小穗也会慢慢感染， 接着蔓延到邻近小穗， 导致小穗枯黄。 湿度大时， 会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生 3 。种子带菌或土壤中病残体侵 染小麦会产生苗腐， 刚感染小麦

2、会变得瘦小，时间长了可能会病死。穗下第一、 二节则容 易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。 小麦赤霉病的发病条件在充足的湿度和空气条件下， 赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子， 最适和的生长温度为 2425，最低 910，最高 32。在适宜的条件下 23d 即可产生子囊壳， 510d 形 成子囊孢子。在小麦抽穗前后， 子囊孢子会随风飘散， 飘落在麦穗上， 子囊孢子会在颖内 花药上腐生， 接着整个花器及小穗都会被感染。 还会产生分生孢子群， 分生孢子会接着随 风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延 4 。气象条件对小麦赤霉病的影响较大。当平均气温为 9以上， 35

3、d 的雨天时，便形 成了子囊孢子。这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。 小麦赤霉病的危害小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一 5，联合国粮农组织（ FAO）统计，每年 由植物病害引起的减产平均损失为总产量的 10% 15%，而其中的 80%的损失是由真菌引 起的6。小麦赤霉病会严重影响小麦的产量， 同时还会降低小麦的品质。 该还能产生以脱氧雪 腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。1950 年以来全国赤霉病大流行 12 年，中度流行 17 年，流行的频率为 46.8%。1985 年全国赤霉病又大流行

4、，仅河南省发病面积就达 3.0 106 hm2。2000 以来赤霉病在中国大 流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有 9 个年份赤霉病的发生面积就超过了3.3 106 hm2。其中仅河南省就有 7年的发病面积超过 6.7 105 hm2。在 2012年的赤霉病大 流行中，山东省南部和西南部较重， 河南省整体偏重， 豫南更重， 安徽和江苏普遍严重 7赤霉病严重威胁小麦的安全生产，一般的流行年份可引起5%10%的产量损失，大的流行年份可导致相当多的田块绝收。 根据调查 20082009年度全国 11 个省的 1018个 饲料样品的毒素污染情况发现， DON 毒素的检出率达 95.8%，超标率

5、达 17.7%，其中西 北地区的超标率高达 38.1%，华北和华中地区的超标率则分别为 21.0%和 20.1%8 。本课题便是用牛肉膏蛋白胨培养基涂布平板法从小麦根际土壤中分离出细菌， 纯化后 用平板对峙法进行初筛和复筛。 通过形态学方法、 生理生化分析进行初步鉴定， 研究其抗 菌活性，为寻找有效抵御小麦赤霉病的方法奠定基础。2 材料与方法2.1 供试病原菌和小麦根际土样供试植物病原真菌：禾谷镰刀菌（ 9435 实验室保存）。小麦根际土样：河南工业大学西门大谢村麦田2.2 试剂及仪器2.2.1 试剂名称及生产厂家试剂名称规格生产厂家蛋白胨BR北京双旋微生物培养基制品厂蔗糖AR天津市瑞金化学品

6、有限公司牛肉浸膏BR北京双旋微生物培养基制品厂可溶性淀粉BR天津市瑞金特化学品有限公司对二甲基氨基苯甲醛AR上海试剂三厂氯化钠AR天津市德恩化学试剂有限公司酵母膏AR北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂粉BR上海化学试剂厂有限公司溴百里香酚兰AR上海三爱思试剂有限公司葡萄糖AR天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠AR天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钾AR天津市化学试剂三厂柠檬酸钠AR湖南省医药公司化玻站硫酸镁AR天津市永远化学试剂开发中心乳糖AR天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙醇AR天津市永大化学试剂开发中心磷酸二氢铵AR天津化学试剂三厂二甲苯AR洛阳昊华化学试剂有限公司硝酸钾AR天津市瑞

7、金化学品有限公司乙酸（冰醋酸）AR开封市芳晶化学试剂有限公司浓盐酸AR洛阳昊华化学试剂有限公司三氯化铁AR天津市化学试剂工厂碘AR天津市科密欧化学试剂有限公司甲基红AR天津市科密欧化学试剂有限公司结晶紫AR天津市化学试剂三厂次氯酸钠AR天津市光复精细化工研究所番红花红 TAR天津市科密欧化学试剂研究所2.2.2 实验仪器仪器名称仪器型号生产公司电热恒温鼓风干燥箱XMTD-8222上海精宏试验设备公司高压蒸汽灭菌锅SX-700日本 TOMY震荡培养箱HZQ-X100哈尔滨市东联电子技术开发有限公司电热恒温培养箱DHP-9052上海浦东荣本科学仪器有限公司台式离心机TDL-5A上海菲恰尔分析仪器有

8、限公司漩涡混合器HQ-60-北京北方同正生物技术发展有限公司无菌操作台SW-CJ-2F苏州净化设备有限公司移液枪KHB上海科华实验系统有限公司电子天平JJ200常熟市双杰测试仪器厂冰箱BCD-155TDGA青岛海尔股份有限公司BCD-232MA/X1海信容声冰箱有限公司洁净操作台SW-CJ-1FD苏净集团苏州安泰空气技术有限公司万用电炉DL-1北京中兴伟业仪器有限公司3pH 计DELTA 320梅特勒 -托利多( METTLER TOLEDO )2.3 试验方法2.3.1 常用培养基的配制方法、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 0.5；蛋白胨 1；氯化钠 0.5；琼脂 2；蒸馏水 100 mL；

9、 pH 7.27.6。步骤： (1) 称量：准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。牛肉膏要玻棒挑 取，放在小烧杯中称量， 用热水溶化后倒入三角瓶。 也可放在称量纸上， 称量后直接放入 三角瓶中， 按比例加水后再稍微加热， 牛肉膏便会溶于水中， 然后立即取出称量纸。 另外 称取蛋白胨时要迅速准确。(2) 融化：可先加少许水量在电炉上加热使其溶解。药品完全溶解后，再补充水分。 将琼脂加到融化的药品中， 不断搅拌加热， 防止琼脂糊底， 烧杯破裂。 最后再补充所失的 水分。(3) 调 pH ：先用精密纸测量培养基的 pH 值，一般 pH 偏酸，再向培养基中逐滴加入 1mol/L 的 NaOH，一

10、边加一边搅拌， 并不停的用 pH 试纸测其 pH 值，直至 pH 达7.27.6。 注意慢调，以避免过碱，再回调 pH，否则，会影响培养基内各离子的浓度，还有可能破 坏培养基的成分。如果有 pH 计，还可以用 pH 计。(4) 分装，加塞，包装：按要求可将培养基分装于试管内或三角烧瓶内。分装时要注 意不要使培养基沾在管口或瓶口上， 避免沾污棉塞而引起污染。 固体若装于试管， 则其装 量不应超过管高的 1/5，灭菌倾斜放置，制成斜面。三角瓶的装量不应超过容积的一半。(5) 灭菌，无菌检查：将上述培养基以 1.05 kg/cm2， 121.3， 20分钟高压蒸汽灭菌。 如不能及时灭菌， 则应放入冰

11、箱内暂存。 灭过菌后再将培养基放入 37的温室中培养 24 48小时，以检查灭菌是否彻底。、 PDA 培养基配方：马铃薯 100；葡萄糖 10；琼脂 10；蒸馏水 500 mL；自然pH。 步骤：(1) 称量：先把马铃薯洗干净， 除去皮 ,再称取 100马铃薯切成小块， 加水煮烂(煮 沸 2030分钟，能被玻璃棒戳破即可) ，用 8 层纱布过滤。(2) 溶解： 可加热后再加琼脂， 搅拌混匀， 待琼脂溶解完后， 加入葡萄糖， 搅拌均匀， 稍微冷却后再补充水分至 500 mL。分装、加塞、包扎、灭菌与上面的相似，如需备用，可冷存。、LB 液体培养基配方：胰蛋白胨 10；酵母提取物 5；NaCl 1

12、0；蒸馏水 1000 mL；pH：7.0 步骤：根据配方配置培养基，液体分装时不超过试管的 1/4 为宜，不超过三角瓶的 1/2 为宜，包扎灭菌等步骤与上面的相似。2.3.2 采取土样在河南工业大学西门口的大谢村小麦地采取土样， 用小铲挖取小麦根系土壤， 选取 个点的小麦根系土壤，混合后备用。2.3.3 分离土样中的细菌将采集到的麦田土壤作为内生细菌分离对象。取采集到的10土样置于装有 90ml无菌水的三角瓶中， 200r/min 震荡 30min即成 10-1菌悬液，将所得的菌悬液吸取 10ml 置 于装有 90ml 的无菌水三角瓶中，依次稀释成 10-4、10-5、 10-6，取 0.1m

13、l 稀释液涂布于装 有牛肉膏蛋白胨培养基的平板上。 4 次重复， 28培养 34d，记录单菌落数量。根据平 板上长出菌落的形态、颜色、大小等特征挑取不同单菌落，反复纯化后接斜面保藏。2.3.4 筛选拮抗细菌1、拮抗细菌的初筛用对峙培养法，取直径为 8 mm 的禾谷镰刀菌菌饼置于 PDA 培养基平板 ( d = 90 mm) 中央，用接种环挑取细菌菌株点接在距离平板中央 30mm 处， 28培养 35d 后测量抑 菌带宽度，以仅接种禾谷镰刀菌的处理为对照， 每个处理重复 4 次。观察菌落的生长变化， 根据公式计算抑制率，筛选出具有拮抗活性的菌株。抑菌率(%) = (对照菌落直径( mm)-处理菌

14、落直径( mm) /对照菌落直径 100%2、拮抗细菌的复筛对有明显抑菌效果的细菌接种于装有 100mL 液体 LB 培养基的三角瓶中，三角瓶置 于 37 摇床中，培养 2d，将混浊的菌悬液注入无菌离心管中离心 10min(5000 rpm) 可得 到上清液。在无菌操作台上，抽取上清液，用细菌过滤器滤去上清液中的细菌。取 200uL 无菌发酵液，涂布平板，待其凉干，接病原菌菌饼，每菌种三个重复并做对照，57d 后观察对峙效果，测量抑菌圈直径或者半径。2.3.5 细菌的生理生化鉴定、形态学观察采用插片法、 埋片法 , 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。 用革兰氏染色进行 油镜观察。 革兰氏染

15、色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液， 95%乙醇，番红复染液试验步骤： (1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片 (不易过厚) 、干燥和固定。(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位 1 min，用水冲洗至流出水无色。(3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖 min，倾去碘液，水洗至 流出水无色。(4) 脱色：在上述涂片上流加 95%乙醇溶液(一般 20 30s)，当脱色至流出液无色时 立即用水洗去乙醇。(5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2min，水洗，用吸水纸 吸去残水晾干。(6) 镜检：用油镜观察。 芽孢染色(1) 制片

16、：按常规方法涂片、干燥及固定。(2) 加热染色： 向载玻片滴加数滴 5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位， 用夹子夹住载玻片 在微火上加热至染液冒蒸汽并维持 min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。(3) 复染：用 0.5%番红水溶液复染 2min。(4) 水洗：用缓流自来水冲洗至无色。(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。 鞭毛染色(硝酸银染色法)(1) 载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后用清水充分洗净，再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌

17、体，悬浮于 12mL无菌水中制成菌悬液， 不能剧烈震荡。(3) 制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，用吸水 纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。(4) 染色：滴加硝酸银染色 A液覆盖35min，用蒸馏水充分洗去 A液，再滴加 B液染 色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥 后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。（5）镜检：用油镜镜检观察。A、B 液需现用现配（ 4h内效果最佳， 1d 内可用）：A：单宁酸 5，三氯化铁 1.5，蒸馏水 100mL，加 1%氢氧化钠 1mL ，15%甲醛 2mL。B：硝酸银粉末 2，水 100m

18、L，溶解匀均，取出 10mL 回滴用，往 90mL 溶液中加 浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加 10mL 回滴液回滴至出现薄雾。、糖类分解试验配方：蛋白胨 1.0； NaCl 0.5；0.2%溴百里香酚兰 1.2mL；葡萄糖 1.0；蒸馏 水 100mL 。基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应， 鉴定细菌能否利用分解某 种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等） 。当发 酵产酸是，指示剂可有紫色（ pH6.8）转变为黄色（ pH5.2）。气体的产生可由倒置的小管 中有无气泡来证明。试验步骤：用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接

19、种的细菌的编号。 取 盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行，可留一个空白， 作为对照。 在接种后要轻摇试管， 防止倒置的小试管进入气泡。 再将将上述已接种的和对 照管置 37温室中培养 23d。观察颜色变化及小试管中有无气泡。、V-P 试验配方：蛋白胨 1.5g；葡萄糖 1.5g；K2HPO4 1.5g；蒸馏水 300mL；pH：7.4 基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。 某些细菌能分解葡萄糖产生 丙酮酸， 丙酮酸再缩合， 脱羧成乙酰甲基甲醇， 后者在强碱环境再被空气中的氧氧化为二 乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称 V-P 反应。试

20、验步骤：将被检菌接种于试验培养基中， 培养 27d后，于培养物中加入 1mL 10 的 NaOH ，混匀，再加入 3 4 滴 2% 氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红 色者，为阳性。、甲基红试验配方：与 V-P 试验的配方相同基本原理： 某些细菌在糖代谢过程中， 会分解葡萄糖产生丙酮酸， 丙酮酸还可进一步 分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基 pH将至 4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红 色，为甲基红试验阳性。 若细菌分解葡萄糖产酸量小， 或者产生的酸进一步转化为其它物 质（如醇、酮、醚、气体和水等） ，则培养基的酸度仍会在 pH6.2 以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。试验

21、步骤：接种细菌于培养基，在 37培养 2 7d 后，于培养物中加入几滴甲基红 酒精溶液（ 0.1甲基经溶于 300mL 95% 乙醇中，加蒸馏水至 500 mL），如呈红色，表示 阳性。、柠檬酸盐利用试验配方：柠檬酸钠 1；硫酸镁 0.2； NaCl 5；NH4H2PO4 1； K 2HPO4 1；琼 脂 20； 1溴麝香草酚蓝酒精溶液 10mL；蒸馏水 1000mL。基本原理：柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。 细菌在分解柠檬酸盐及培 养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，是培养基的 pH 升高，当加入 1%溴麝香草酚蓝指 示剂时，培养基就会有绿色转变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：

22、pH 小于 6.0 时呈黄色， pH在6.57.0时为绿色， pH大于 7.6时呈蓝色。试验步骤：将被检菌接种到 Simmons固体柠檬酸盐培养基上， 37下培养 24d，能利用 柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长， 培养基不变色。、硝酸盐还原试验配方：硝酸钾 0.2；蛋白胨 5；蒸馏水 1000mL；pH： 7.4。甲液： -苯胺磺酸（对氨基苯磺酸） 0.4； 5mol/L 冰醋酸 50mL。乙液： -萘胺 0.25；5mol/L 冰醋酸 50mL。基本原理： 某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸， 亚硝酸与试剂中的 -苯胺磺酸 作用生成重氮基苯磺酸，后者与 -萘胺结合生成 N-萘胺 偶苯磺酸。试验步骤： 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中， 37培养 12d，每管中先加入甲试 剂 0.1mL ，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。注：本试验阴性的原因有三： 细菌不能还原硝酸盐； 亚硝酸盐继续分解， 生成氨和氮； 培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许， 可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。、淀粉水解试验配方：牛肉膏 0.5；蛋白胨 1；氯化钠 0.5；可溶性淀粉 0.2；蒸馏水 1