李斯特菌检验应用

1、李斯特氏菌李斯特菌是 1926 年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的， 1940 年被第三届 国际微生物学大会命名为李斯特菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 李斯特氏菌 - 概况李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状， 伴有内脏 器官 和中枢 神经系统病变。李斯特菌是 1926 年英国南非裔科学家 穆里在病死的兔子体内首次发现的， 为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家 约瑟夫·李斯特 （1827 1912）， 1940 年被第三 届国际微生物学大会命名为李斯特菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的 病原菌 。它能引起人畜的李氏菌

2、的病， 感染后 主要表现为 败血症 、脑膜炎 和单核细胞增多。 它广泛存在于自然界中， 食品中存在的单增李 氏菌对人类的安全具有危险，该菌在 4的环境中仍可生长繁殖，是 冷藏食品 威胁人类健康 的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。 肉类、蛋类 、禽类 、海 产品、乳制品、 蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。 李斯特菌中毒严重的可引起血液和 脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。 其中单增李斯特菌是唯一能引起人类 疾病 的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的 病

3、原菌。它能引起人、 畜的李氏特菌病， 感染后主要表现为败血症、 脑膜炎和单核细胞增多。李斯特氏菌 - 特点李斯特菌快速检测试剂盒1、分布 广：存在于土壤、水域 （地表水、污水、废水 ） 、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生 动物、家禽。2、生存 环境 可塑性大：能在 2-42 下生存 （也有报道 0能缓慢生长 ）能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。3、适应 范围 大：酸性、碱性条件下都适应。4、带菌较高的 食品有：牛奶和乳制品；肉类 （特别是牛肉 ） ；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌 等。李斯特氏菌 - 生存环境单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在 土壤中能存活

4、5 个月以上，在冰块内也可存活 3 5 个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。这种细菌对高温的 反抗力 也比较强，能在 100 下挺 1530 分钟，在 70下可存活 30分钟以上。单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中， 不易被冻融， 能耐受较高的渗透压， 在土壤、 地表水、 污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口 腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%, 有70%的人可短期带菌， 4-8%的水产品、 5-10%的奶及其产品、 30%以上的肉制品及 15%以上的家禽均 被该菌 污染 。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的

5、鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴 氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感 染，约占 85-90%的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过 眼及破损 皮肤 、粘膜 进入体内而造成感染， 孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿 或新生儿 , 栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有 上升趋势。李斯特氏菌 - 生物学特性1、形态与染色单核细胞增多性李斯特菌鞭毛染色该菌为 革兰氏阳性短杆菌 ，大小约为 0.5 m1.0-2.0 m,直或稍弯，两端钝圆，常呈 V字 型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富

6、的环境中 可形成荚膜， 在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性， 该菌有 4根周毛和 1根端毛， 但 周毛易脱落。2、培养特性该菌营养要求不高，在 20-25 培养有动力，穿刺培养 2�5 天可见倒立伞状生长，肉汤 培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2-42 （也有报道在 0能缓慢生长），最适培养温度为 35-37 ，在 pH中性至弱碱性（ pH9.6 ）、氧分压略低、二氧化碳 张力略高的条件下该菌生长良好，在 pH3.8�4.4 能缓慢生长，在 6.5% NaCl 肉汤中生长 良好。在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的

7、增大， 变得不透明。在 5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄 小的 -溶血环。在 0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂 （TSAYE）和改良 Mc Bride（MMA） 琼脂上，用 450 角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。3、生化反应电子显微镜下的单核细胞增多性李斯特菌该菌触酶阳性， 氧化酶阴性， 能发酵多种糖类，产酸不产气， 如发酵葡萄糖 、乳糖、水杨素、 麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、 肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化

8、氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。4、血清型根据菌体（ O）抗原和鞭毛 （H）抗原 ，将单增李氏菌分成 13个血清型，分别是 1/2a 、1/2b 、 1/2c 、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“ 7”13 个血清型。致病菌株的血清型一 般为 1/2b 、 1/2c 、3a、3b、3c、4a、1/2a 和 4b, 后两型尤多。5、抵抗力该菌对理化因素 抵抗力 较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活， 对碱和盐抵抗 力强， 60-70 经 5-20min 可杀死， 70%酒精 5min、 2.5%石炭酸、

9、2.5%氢氧化钠、 2.5%福尔 马林 20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。李斯特氏菌 - 致病性澳洲食物中毒引发高度关注 单增李斯特菌进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄 免疫 状态有关，因为该菌是一种细胞内 寄生菌 ，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、 40 岁以上 的成人，免疫功能缺陷者。潜伏期在感染后 3-70 天出现症状，健康成人可出现轻微类似 流感 症状，易感者突然发热，剧烈头 痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。病性机理 单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：1、寄生物介导的细胞内增生

10、，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞 ；2、抗活化的 巨噬细胞 ，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的 过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李斯特杆菌溶血素 O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有 和 两种，为毒力因子。临床表现健康成人个体出现轻微类似流感症状， 新生儿、 孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、 呕吐、 出血性皮疹、化脓性结膜炎、 发热 、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。 控制单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活， 热处理 已杀灭了竞争性细菌群， 使单增李斯特 氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活， 所以在食品加工中，

11、中心温度必须达到 70持续 2 分钟以上。 单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在， 所以即使产品已经过热 加工 处理充分灭活 了单增李斯特氏菌， 但有可能造成产品的二次污染， 因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。 由于单增李斯特氏菌在 4下仍然能生长繁殖， 所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危 险。冰箱食品需加热后再食用。李斯特氏菌 - 检验1、增菌培养1. 将未开封的测试片贮藏在 <= 8 oC (46 oF) 的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。 在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。取回的样品应在 4下处理、存放和 运送 ，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。 取

12、 25mL液体或 25g 半固体或固体样品放入含有 225mL 无选择性试剂增菌肉汤( EB)的均质 杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30培养 4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养 20h 和 44h. 。2、分离共培养 24h和48h后，取EB培养物分别在 OXA和LPM或加七叶苷 /Fe3 LPM琼脂平板上划线。 PALCAM琼脂可替代 LPM琼脂。将 OXA和 PALCAM平板置于 35培养 24-48h ，LPM平板在 30 培养 24-48h 。然后，把 LPM平板放于解剖镜载物台上，以450 角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。 李斯

13、特氏菌在 LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。 用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。2. 已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。 在 OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环， 其它菌也可形成黑色环， 但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和 OXA平板上的菌落特征相似。在 PALCAM和 OXA或 LPM平板上挑取 5 个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。 食品检验 中在 TSAYE平板上纯化是必须的，因为在 PALCAM和 OXA或 L

14、PM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取 5 个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30TSAYE平板培养 24-48h ，如果不用于动力观察，也可在 35 培养。3、鉴定步骤3. 为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。将胶带封好的测试片贮藏在 低温干燥的地方，保持时间不超过 1 个月。请勿将测试片放在温度 > 25 oC (77 oF) 和(或) 相对湿度 > 50%的环境中。（1）观察 TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对照。（2）、从 30或更低温度下培养的 TSAYE平板上挑取典型菌落

15、做成湿玻片在油镜下观察。 湿玻片用 0.85%生理盐水菌悬液制成。 如果菌量太少， 菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。 李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、 大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。（3）挑取典型菌落进行过 氧化氢酶 实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。（4）取 16-24h 的培养物进行革兰氏染色， 李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。 但是陈旧培养物 革兰氏染色会发生变化， 而且菌体可成球形。 在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势， 易误认为白喉菌而错判。4. 用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。湿润采样设备的液体应<=

16、10 mL。湿润剂可以是无菌水、 缓冲蛋白胨水 （Buffered Peptone Water, BPW），或中和缓冲液， 如 Letheen 肉汤或 Dey/Engley （DE） 中和肉汤。（5）挑取典型菌落接种于 TSBYE肉汤管中， 35培养 24h 用做糖类发酵和其它生化项目实 验。 TSBYE肉汤管在 4下可存放几天，也可反复接种。（6）在 TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到 5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到 平板底部和使琼脂破裂， 同时设阳性对照 （单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌） 和 阴性对照（英诺克李斯特氏菌）， 35培养 48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈

17、窄小的 -溶 血环。（7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特 氏菌围绕穿刺点产生较清晰的 - 溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯 特氏菌产生界限明显的较大溶血环， 在此不要试图进行种间的区分， 但要记录下溶血反应的 特征， CAMP试验可区分它们间的溶血反应。（8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中， 35培养 5 天后，加入 0.2mL试剂 A，再加入 0.2mL 试剂 B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明硝酸盐 已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h ，如出现紫红色，表明硝酸盐仍存在，

18、未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐， 因此，从格氏李斯特氏菌中区 分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。 本试验还有一等效试验， 即加入 0.2mL 试剂 A后，再加入 0.2mL 试剂 C，出现橙色表明硝酸盐已被还原。如未出现颜色反应，也加入少 量锌粉，若出现橙色表明硝酸盐未被还原。5. 在无菌环境下在收集的样品中添加5 mL，20-30oC ，灭过菌的缓冲蛋白胨水 （BPW）溶液。不要将 Petrifilm EL测试片与 Vermont 培养基 （UVM）、 Fraser 肉汤、李斯特菌增菌培养基 （LEB） 或缓冲李斯特菌增菌培养基 （BLEB）共用。（9）将 TSBYE培养物穿刺到 SIM和 MTM试管中，室温培养 7天，每日观察，李斯特氏菌呈 典型伞状生长。 在 MTM中伞状生长更典型。 同时， 30的 TSBYE培养物在油镜下可见细菌作 翻转运动。10）将 TSAYE肉汤培养