离体实验模型在评价神经保护剂中的应用

1、    离体实验模型在评价神经保护剂中的应用        离体实验模型在评价神经保护剂中具有其独特的优点，它可解决在体动物实验所不能或极为困难解决的问题，还可评价药物在神经生化、电生理、基因表达等方面的作用，通过以上指标进一步探讨损伤的细胞机制；同时对研究神经细胞的生长分化、神经再生、突触建立、学习和记忆、神经调节、离子通道、神经免疫等具有广泛应用价值。 1离体实验模型神经科学研究中的离体实验模型包括单纯神经细胞、脑片培养模型、氧糖等营养物质剥夺模型，药物或毒物致损伤模型、

2、物理因素致损伤模型及具有神经细胞样特性的细胞如PC12细胞株培养模型。1.1离体分散神经细胞培养模型包括神经元、神经胶质细胞和两者混合培养模型。实验动物多选用大白鼠，亦可选用小鼠、鸡、猴等。动物年龄多为胚胎后期组织，亦可为出生后数日内，按培养的目的和培养的部位不同而不同。如大脑皮层多取19天左右的大鼠胚胎或18天左右的小鼠胚胎较合适；小脑浦肯野细胞多取自大鼠胚胎；小脑颗粒细胞培养则应取自出生后的动物。培养基本过程包括取材、酶消化或机械分离、制备细胞悬液、接种。分散神经细胞培养的最大优点为可选择细胞培养的类型，如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等和选择一定的部位如皮层、小脑、海马区等。1.2离

3、体脑片培养模型脑片培养最初是应用动态滚轴技术进行培养，手续烦琐，效果不理想。到90年代初，Stoppini等1发明了静态脑片培养技术，神经组织的器官特征保持良好，培养效果理想。脑片培养的动物一般以幼年为佳。培养过程包括取材、切片和培养，可用于形态学研究、电生理、基因表达等方面研究。1.3氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)离体培养模型在离体培养的基础上给以OGD模拟在体缺血，又称“离体缺血模型”。它包括化学性缺血模型、氧糖直接剥夺模型及造成氧糖剥夺的其它方法。化学性缺血模型即通过药物阻止能量的产生，如氰化物可通过与细胞色素氧化酶紧密结合抑制氧化磷酸化

4、过程，阻止线粒体产生ATP。此模型的优点为无需特殊设备，制备迅速，可在正常空气环境下检测培养细胞。缺点为它不能很好地模拟在体急性脑缺血和再灌注。此外，影响代谢的药物对细胞还可能有其它作用，如氰化物不仅阻断线粒体复合体，而且还能阻止铜锌过氧化物歧化酶。OGD模型可通过直接通入不同浓度的氮气和二氧化碳等混合气体或其它隋性气体造成低氧或缺氧环境，同时培养基中剥夺糖来完成。此法可模拟在体脑缺血模型，但需要特殊设备。Goldberg等2利用套箱型缺氧工作室成功建立了离体缺血培养模型。国内多采用将培养的细胞放于密闭容器内，通入氮气和二氧化碳混合气体，一定时间内达到缺氧的目的；亦有研究者将培养板或培养瓶直接

5、密封一定时间，待氧气耗尽，达到缺氧的目的。此外，营养物质剥夺模型还包括血清、神经营养因子、离子剥夺等。1.4药物或毒物致损伤模型包括上述化学性缺血模型，还包括兴奋性氨基酸3、自由基4等药物直接致损伤模型。1.5物理因素致损伤模型包括低温、热辐射等，其中低温对细胞的保护和损害的研究极为重要，为临床适度低温治疗神经系统疾病提供了理论依据。Onitsuka等5发现适度低温至33可保护海马区脑片CA1区神经细胞由于“缺血”所致的细胞损害。2离体实验模型的优点和缺点离体实验模型的实验条件易于控制、恒定；实验周期短；可在“缺血”损害的过程中评价细胞的功能。离体实验模型的开放性使我们更易于应用光学仪器进行细

6、胞功能的观察。离体药物评价可以避开在体动物实验中复杂的药代动力学、药物的转运途径、血脑屏障的通透率、组织的分布和靶细胞膜的渗透性，使药物直接作用于神经细胞，可以计算出药物的有效浓度和直接评价药物的作用。由于细胞外环境可以控制，很容易评价离子成分的作用。离体实验样本量大；神经细胞活性评价快速且直接。离体实验模型亦有不足之处，分离出的神经细胞与在体成年动物对应部位的神经细胞表现型不同，并且缺乏三维立体结构及相互连接。实验药物在细胞培养中能够减轻细胞损害，但是在动物实验模型中并不一定表现出神经保护作用。离体实验模型在筛选神经保护药物中起重要作用，但是疗效的最后验证尚需在体动物实验模型上完成。3离体实

7、验检测神经细胞死亡的方法目前认为细胞死亡存在坏死和凋亡两种形式。利用光、电镜、激光共聚焦显微镜、DNA断端原位末端标记(TUNEL)，线粒体荧光染科等技术观察细胞体、DNA、线粒体和细胞的形态变化；利用染料排除实验、LDH释放和线粒体膜电位的敏感荧光染料等方法可以从功能上了解细胞膜、酶和线粒体在凋亡和坏死中的变化；大分子合成抑制剂可挽救凋亡，但不能挽救坏死。利用细胞的形态、功能和对药物的反应的不同可鉴别凋亡和坏死。但应注意利用单一的方法来鉴别是不充分的，损害后的凋亡和坏死形式并不是相互排斥的，相互孤立的，可能反应了一个连续统一体。Seth等6利用苔盘蓝染料排除实验和TUNEL方法对培养的神经元

8、进行了同步坏死和凋亡的观察。4离体实验模型的应用包括对离子、离子通道和递质、受体的研究及其拮抗或激动剂；酶抑制剂；自由基清除剂、神经营养因子及中药等神经保护作用的评价。4.1离子、离子通道拮抗或开放剂Yamamoto等7采用鼠海马脑片OGD模型，发现OGD6min可产生一个快速的去极化，当溶液中Na+或Ca2+降低和存在Co2+或Ni2+时，持续性去极化的高峰将降低；相反，外界的K+或Cl-的降低或加入河豚毒素(TTX)，氟苯桂嗪或硝苯地平均不影响去极化。此结果提示持续性Na+或Ca2+内流将产生持续性去极化。细胞外Ca2+降低或Co2+的加入是促进持续性去极化恢复的有效方法，提示Ca2+内流

9、是引起膜功能损害的主要原因。谷氨酸受体拮抗剂CNQX、AP5可减少剂量依赖性的去极化水平。Pisani等8采用皮层神经元OGD模型对电生理变化、胞内钙离子进行测定，发现OGD8-2min可致细胞膜超极化，随后出现迟发的幅度较大的可恢复的去极化，伴随胞内钙离子的暂时升高；L型钙通道拮抗剂尼莫地平、硝苯地平可明显减轻上述变化。Pringle等9利用鼠海马脑片培养发现N型钙通道拮抗剂Omega Conotoxin MVILA可减轻缺氧所致的海马神经元的损害，而双氢吡啶类的硝苯地平和混合型钙通道拮抗剂SB201823-A无保护作用。此外，还有人发现钠通道拮抗剂TTX、苯妥英钠和利多卡因可减轻OGD所致

10、鼠海马脑片的损害。4.2递质、受体及其拮抗剂或激动剂Small等10利用鼠海马脑片OGD模型，采用逆转录PCR技术发现OGD后再灌注90min海马脑片易损CA1区和耐损CA3区和齿状回NMDA受体亚型mRNA表达有所不同，NR2C的表达相对于NR2B、NR2A的表达明显增加，这为我们寻找新的特殊的神经保护剂提供了依据。Calo11等则发现大脑皮层脑片OGD可产生一早期和迟发的谷氨酸释放效应，这一效应是钙非依赖性的，可被介质中的低钠所加强。Mclaughlin等12将原代培养的纹状体神经元中加入多巴胺产生剂量依赖性的细胞死亡，且线粒体功能抑制剂甲基丙二酸酯可加强多巴胺的毒性，抗氧化剂和自由基清除

11、剂可减轻细胞损害。在OGD模型中兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK801、CNQX可减轻OGD导致的神经元兴奋毒性坏死和凋亡。MK801、CNQX还可直接保护谷氨酸 NMDA对神经元的损害。4.3酶抑制剂Cardenas等13利用鼠脑片OGD模型发现NOS抑制剂N3甲基苯甲基已脒可减轻组织损害和iNOS活性。Villalba等14利用小脑颗粒细胞培养氯化钾剥夺凋亡模型发现一种特异性PKC抑制剂Bisindolylmaleimide可阻止培养细胞的凋亡；Ro-31-8220,另一种PKC抑制剂亦可减轻凋亡，但作用较弱，这可能由于缺乏特异性所致。此外，在离体各种原因所致的凋亡模型中，caspase抑制剂表

12、现出明显的抗凋亡作用15。4.4自由基清除剂Noh等4利用Fe2+或Buthionine sulfoximine致培养的鼠皮层神经元损伤模型，发现选择性多巴胺D1激动剂SKF-38393和亲脂性维生素E的类似物trolox可显著减少氧化应激有关的神经元的坏死，而Quinelorane,选择性多巴胺D2激动剂对自由基的神经毒性无保护作用，这为治疗与氧化应激有关的神经变性疾病提供了依据。近来发现氧化应激参与神经元的兴奋毒性和凋亡过程，一种新型的抗氧化剂Buckminsterfullerenols,多羟基化的C60衍生物具有极强的抗自由基作用和减轻NMDA、AMPA或Kainate对培养神经元的兴奋

13、毒性，减少神经元凋亡的作用；电生理和45Ca2+追踪研究显示此药不是NMDA或AMPA/kainate受体拮抗剂3。4.5神经营养因子类Ohgoh等16采用脑皮层神经细胞混合培养1周，剥夺星形胶质细胞24天后，神经元出现凋亡，当加入神经营养因子NT-3、NT-4、BDNF和GDNF后可挽救神经元凋亡。同时，白介素1转换酶(ICE)和CPP32抑制剂可阻止细胞凋亡。此外，利用神经细胞培养还可检测神经营养因子是否存在及其作用。4.6其它离体实验模型在评价中药的神经保护方面有重要作用。此外，利用离体实验模型还可研究缺氧预置的作用机制，胶质细胞的抗损伤作用等。离体实验模型在研究神经变性疾病、脱髓鞘性疾

14、病、老年性痴呆和癫痫等神经系统疾病的病理机制中亦起重要作用。总之，离体实验模型在评价神经保护剂及其它神经系统疾病的病理机制中有其独特的优点。我们应充分认识离体实验模型的作用、优缺点、选择合适的实验模型，从不同的侧面，来研究神经细胞死亡及损伤机制，开发新的神经保护剂。基金项目：本课题受国家自然科学基金重点项目资助(No.39730170)作者单位：张拥波董为伟400016重庆医科大学神经病学研究所参考文献1 Stoppini L,Buchs PA,Muller D.A simple method of organotypic cultures of nervous tissue.J Neuros

15、ci Methods,1991,37:173.2 Goldberg MP,Strasser U,Dugan LL.Techniques for assessing neuroprotective drugs in vitro.In:Neuroprotective agents and cerebral ischemia.San Diego:Academic Press Limited,1997:70.3 Dugan LL,Gabrielsen JK,Yu SP,et al.Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitoto

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