反义多重耐药性基因抑制眼睫状体非色素上皮细胞容积激活性氯电流

1、    反义多重耐药性基因抑制眼睫状体非色素上皮细胞容积激活性氯电流            关键词：离子通道；寡核苷酸类，反义；抗药性；基因表达    中国病理生理杂志000722    摘 要 目的：研究多重耐药性(MDR1)基因及其产物P糖蛋白(P-gp)与容积激活性Cl-电流的关系。方法：用膜片钳全细胞记录技术记录牛眼睫状体非色素上皮(NPCE)细胞容

2、积激活性Cl-电流，反义寡核苷酸阻抑细胞MDR1基因表达，在激光共聚焦显微镜下检测细胞P-gp免疫荧光。结果：P-gp免疫荧光与人源反义MDR1呈剂量依赖性减弱关系,容积激活性Cl-电流被人源反义MDR1特异性地部分阻抑，电流潜伏期延长，峰电流值减少，电流抑制率与人源反义MDR1呈现剂量依赖性增强关系,(r=0.99， P<0.01)。 P-gp表达抑制率和容积激活性Cl-电流抑制率高度正相关(r=0.99， P<0.01)。结论：MDR1基因及其产物P-gp参与NPCE细胞容积激活性Cl-电流的形成。    中分类号 Q 25 文献标识码

3、A    文章编号 1000-4718(2000)07-0658-05    Multidrug-resistance antisense inhibits volume-activated chloride    current in non-pigmented ciliary epithelial cells    CHEN Li-xin, Wang Li-wei    (Department

4、 of Physiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)    Abstract AIM： To study the relationship between multidrug-resistance (MDR1) gene product P-glycoprotein (P-gp) and the volume-activated chloride current. METHODS:The volume-activated chloride current in bovine

5、 non-pigmented ciliary epithelial cells was recorded using a whole cell recording technique. An antisense technique was used to inhibit the expression of MDR1 gene. The immunofluorescence of P-gp was monitored with a real-time laser confocal microscope.RESULTS:P-gp immunofluorescence correlated nega

6、tively with the concentration of the human MDR1 antisense oligonucleotide. The antisense oligonucleotide inhibited the volume-activated chloride current specifically and partially. The latency of activation of the current increased and the peak current decreased. The percentage of inhibition of peak

7、 current correlated positively to the concentration of the antisense oligonucleotide(r0.99, P<0.01) and to the reduction(%) of P-gp immunofluorescence(r=0.99,P<0.01).CONCLUSION:P-gp, the product of MDR1 gene, plays an important role in the activation pathway of volume-activated chloride curren

8、t in non-pigmented ciliary epithelial cells.    MeSH Ion channels; Oligonucleotides, antisense; Drug resistance; Gene expression    睫状体非色素上皮(non-pigmented ciliary epithelium, NPCE)细胞分泌房水机制与细胞容积调节有关。NPCE容积激活性Cl-通道起着调控房水分泌速率的重要作用1。资料表明,多重耐药性(multidrug-resistance

9、， MDR1)基因可能参与容积激活性氯电流的形成2。MDR1基因产物P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在容积激活性氯电流的形成中的作用如何仍未确定。本研究用基因阻断技术(antisense technique)阻断NPCE的MDR1基因表达,观察容积激活性氯电流的改变,以阐明二者之间的关系。    材 料 和 方 法    一、细胞分离和培养    睫状体上皮细胞分离和培养的方法见文献3。    二、反义寡核苷酸处理细

10、胞    本实验所用鼠源和人源两种MDR1反义寡核苷酸(MDR1 antisense oligonucleotide,反义MDR1，Severn Biotech Ltd, UK)用高效液相层析法提纯，其序列详见文献3。用阳离子脂质体lipofectin (Gibco BRL, USA)促进细胞摄取反义寡核苷酸。    实验分组:空白对照组;阳离子脂质体组(lipofectin 20 mg/L);鼠源反义MDR1组(M-LA; lipofectin 20 mg/L和鼠源反义MDR1各10、50、100、200 mg/

11、L);人源反义MDR1组(H-LA; lipofectin 20mg/L和人源反义MDR1各10、50、100、200 mg/L)。各处理组分别在E199培养液中加入上述药物,培养48 h 后, 进行P-gp免疫荧光标记和测定,记录全细胞电流。    三、P-gp免疫荧光测定    用免疫荧光法检测P-gp的水平，以了解反义MDR1阻抑MDR1基因的程度。细胞培养、处理48 h后，磷酸盐(PBS)溶液漂洗细胞，聚甲醛固定，Triton X-100浸浴，羊血清封闭，JSB-1阳性对照组和处理组加入小鼠抗P-gp抗体J

12、SB-1 (Monosan, Netherlands), 置于冰箱中过夜(1416 h)。JSB-1阴性对照组不加抗体JSB-1。加入FITC标记的羊抗鼠Ig-G(Sigma)，置暗处孵育1 h，在激光共聚焦显微镜(Noran Instruments, USA)下检测荧光，用metamorph像分析系统(Universal Imaging Corporation, USA )拍摄、分析像，荧光强度(灰白度)单位：Unit，0 Unit最弱，255 Unit最强。    四、全细胞记录    用EPC-7膜片钳放大器

13、(list electronic, Germany)记录单独的NPCE细胞全细胞电流。微电极尖端电阻510 M。电流和电压信号用CED1401(Cambridge, UK)数字化(采样频率3 kHz)，实验数据用EPC(CED, Cambridge, UK)软件分析。钳制电压模式：细胞被钳制在0 mV, 以0, ±40, ±80 mV不断反复循环，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔4 s。细胞玻片安放在灌流槽中，用等渗液灌流5 min, 记录稳定的背景电流，改灌低渗液，待电流升高7 min后，重新灌流等渗液，连续观察和记录电流。实验在室温(2024)下进行。 &#

14、160;  五、溶液    使用特配的溶液以记录Cl-电流。电极液含(mmol/L):105 N-methyl-d-glucamine chloride (NMDG-Cl), 1.2 MgCl2, 10 Hepes, 1 EGTA, 70 D-manitol, 2 ATP。等渗灌流液含(mmol/L):105 NaCl, 0.5 MgCl2-电流 如2A所示,对照组细胞被钳制在0,+40,-40, +80, -80 mV(钳制电压模式见2C),在等渗液灌流期间仅记录到微弱的背景电流,在12个细胞上观测到相同的结果。然而，以230 mO

15、sm/L的低渗液灌流时,记录到一个几乎不失活、持续、较大的电流，其外向电流(向上)和内向电流(向下)均显著增加,但外向电流占优势。2B显示低渗液灌流9 min瞬时记录的电流。2D显示实验全过程电流变化(在每个钳制脉冲第10 ms处采样)。在低渗液灌流13 min后,电流开始上升,持续灌流低渗液,电流持续增加,电流上升57 min后,上升速度减弱趋向平稳,将上升7 min时的电流值作为峰电流。重新灌流等渗液时,电流逐渐衰减,直至基本恢复到低渗液灌流前的对照水平,恢复时间大约1030 min。    在等渗液灌流10 min和低渗液灌流产生电流后7 min记

16、录电流,作电流-电压曲线(2E)。由于电极液和灌流液两种液体均不含K+，Cl-浓度几乎完全相等,氯离子平衡电位(ECl)等于零。测得低渗液激活的电流在(-4.9±0.5) mV反转,很接近氯离子平衡电位。Cl-通道阻断剂tamoxifen基本阻断此电流(阻抑率87.6%, n=5，P<0.01),因此,Cl-是形成此电流的主要离子(详见讨论)，此电流是容积激活性Cl-电流。    Lipofectin组细胞对低渗液刺激引起的电流反应与对照组相似。    (二)反义MDR1对容积激活性Cl-电流的影响

17、 鼠源反义MDR1组细胞对低渗液刺激下的全细胞电流反应和电流-电压曲线与对照组相似(3A),M-HL各组产生容积激活性Cl-电流的潜伏期和峰电流与对照组相比均无显著差异(表1)。    人源反义MDR1明显抑制低渗液激活的Cl-电流，表现为潜伏期显著延长,峰电流明显减弱，其全细胞电流反应和电流-电压曲线见3B。潜伏期及峰电流值详见表1。    三、人源反义MDR1剂量与P-gp免疫荧光和容积激活性Cl-电流的关系    Fig 2 Volume-activated chlor

18、ide current (±s，n=12) Iso: isotonic solution; Hypo: hypotonic solution    2 容积激活性氯电流    Fig 3 Effect of MDR1-antisense on volume-activated chloride current (±s, A:n=8, B:n=25)    3 反义MDR1对容积激活性氯电流的影响    表1 反义MD

19、R1对容积激活性氯电流的影响    Tab 1 Effects of MDR1-antisense on volume-activated chloride current (±s) Group    n    Latency (s)    Current    (Isotonic)(pA)    Current   

20、 (Hypotonic) (pA)    Control    12    126.9±84.5    38.8±15.5    1 596.3±368.9    Lipofectin    15    118.4±73.2

21、60;   39.9±13.9    1 471.3±382.7    M-LA10    13    122.9±74.3    42.8±16.6    1 607.1±311.5    M-LA 50   

22、; 7    129.3±95.5    41.1±22.5    1 549.0±203.2    M-LA 200    8    130.2±61.4    43.3±19.0    1 569.5±22

23、4.6    H-LA 10    10    174.3±87.0    48.1±13.3    1 379.7±273.5    H-LA 50    9    232.6±127.5* *   

24、0;37.0±9.9    1 150.8±448.5*    H-LA 100    13    256.3±150.7* *    44.3±17.3    817.5±384.0* *    H-LA 200    25&#

25、160;   265.4±123.5* *    41.6±18.5    541.8±270.5* *    * P<0.05, * P<0.01， vs control    随着人源反义MDR1浓度的提高,对容积激活性Cl-电流的抑制作用逐渐增强(4),即容积激活性Cl-电流的抑制率与人源反义MDR1呈剂量依赖性增强关系,两者呈高度正相关(r=0.99, P&

26、lt;0.01)。人源反义MDR1对P-gp表达的抑制率与其对容积激活性Cl-电流的抑制率相似,两种抑制率间高度正相关(r=0.99, P<0.01)。表明P-gp表达水平高低直接影响容积激活性Cl-电流的大小。    Fig 4 Blocks (%) of P-gp immunofluorescence and volume-activated chloride current by human MDR1-antisense (±s， n)    4 人源反义MDR1对P-gp免疫荧光和容积激活性

27、氯电流的抑制百分率    讨 论    本实验结果显示在低渗液刺激下NPCE细胞产生一个较强的电流。本实验所用电极液(细胞内液)和灌流液(细胞外液,包括等渗液和低渗液)主要离子是Cl-, Na+, Ca2+,细胞内外液Cl-浓度相等,细胞外液Na+, Ca2+浓度高于细胞内。当细胞被钳制在电压0, +40, -40, +80, -80 mV,在等渗液灌流条件下,基本没有电流产生,表明此时低电导,基本没有通道开放。在低渗液灌流时,当钳制电压为0 mV时,没有电流产生, 表明Na+, Ca2+通道不开放,虽然细胞外液N

28、a+, Ca2+浓度高于细胞内,但由于这些离子通道不开放,故没有内向电流产生,当钳制电压为80 mV时,出现一外向电流,外向电流方向与Na+, Ca2+由于化学浓度差所形成离子内流的流动趋势相反,因此，此电流不可能是Na+, Ca2+等正离子外流而形成,而只能是负离子内流而形成。本实验灌流液中唯一的负离子是Cl-,所以此电流只能是Cl-内流而形成。当钳制电压为-80 mV时,则刚好相反, Cl-外流,形成内向电流。容积激活性Cl-电流反转电压-4.7 mV,与氯离子平衡电位(ECl=0)非常接近,而此条件下，Na+、Ca2+平衡电位大于+200 mV,也表明此容积激活性电流是Cl-携带形成。C

29、l-通道阻断剂tamoxifen基本阻断此电流，更证明此电流是Cl-电流。    MDR1基因产物P-gp在容积激活性氯电流的形成中的作用如何，有许多争议46。我们以往的工作表明，MDR1基因与细胞容积调节有关3。本实验用基因表达抑制剂人源反义MDR1特异性阻抑MDR1基因表达后，该基因产物P-gp减少，容积激活性Cl-电流减弱，P-gp免疫荧光与容积激活性Cl-电流之间高度正相关。而鼠源反义MDR1对P-gp免疫荧光和容积激活性Cl-电流都没有影响，因此，可以认为MDR1基因通过其产物P-gp参与容积激活性Cl-电流的形成。  &#

30、160; 本研究用人源反义MDR1最高浓度为200 mg/L, 只能部分抑制容积激活性Cl-电流,其中原因之一可能是NPCE细胞存在着与其它基因有关的Cl-电流7，8,换言之，MDR1基因并非唯一与容积激活性Cl-电流有关的基因，这有待于进一步的实验证实。容积激活性Cl- channels associated with ciliary epithelial homologue of pIClnJ. Am J Physiol, 1995, 268: C572C579.    2 Valverde MA, Diaz M, Sepulveda M, et al. Volume regulated chloride channels are associated with the human multidrug-resistance P-glycoproteinJ. Nature, 1992, 355: 830833.    3 陈丽新，王立伟， Jacob T.