地塞米松对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡及Fas基因与Fas基

1、    地塞米松对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡 及Fas基因与Fas基因配体系统表达的影响        摘要：目的探讨细胞凋亡与急性肺损伤（ALI）发生、发展的关系以及地塞米松在全身炎症反应及急性肺损伤中的作用机制及意义。方法通过复制内毒素性大鼠ALI模型，采用TUNEL法、原位杂交、SqRT-PCR以及免疫组化等技术观察ALI肺组织细胞凋亡变化、Fas基因与Fas基因配体(Fas/FasL)系统mRNA和蛋白质表达的改变以及地塞米松对细胞凋亡及Fas、FasL表

2、达的影响。结果ALI早期肺组织细胞凋亡明显增加(P<0.01)；Fas、FasL mRNA和蛋白质表达明显上调(P<0.01)，地塞米松可明显抑制大鼠ALI血清TNF-释放、抑制肺部炎症反应；明显抑制LPS诱导的肺组织细胞凋亡(P<0.01)，并明显下调Fas、FasL mRNA和蛋白质的表达(P<0.01)。结论肺组织细胞凋亡及Fas/FasL系统表达上调，可能参与大鼠ALI早期的发病；地塞米松可通过抑制炎症介质释放，抑制Fas/FasL系统的活化，阻断、调控肺组织靶细胞凋亡，而减轻肺组织损伤。关键词：急性肺损伤；内毒素；地塞米松；细胞凋亡；基因表达Effects o

3、f dexamethasone on apoptosis and expression of Fas/FasL system in lung tissues of ALI ratsSONG Yong(Department of Respiratory Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002, China)MAO Baoling(Department of Respiratory Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanj

4、ing 210002, China)QIAN Guisheng(Department of Respiratory Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002, China)Abstract：ObjectiveTo determine whether apoptosis occurs in the lung tissues from rats with acute lung injury (ALI), and observe protective effects of dexamethasone b

5、y regulating apoptosis of lung tissues in rats with ALI. MethodsBy using TUNEL, in situ hybridization, SqRT-PCR and immunocytochemistry techniques, apoptosis and Fas, FasL expression were studied during early phase of ALI in rats. ResultsLPS leads to the rapid appearance of apoptosis in alveolar epi

6、thelial cells and pulmonary vascular endothelial cells at early stage of ALI in rats. The expression of Fas, FasL mRNA and protein was up-regulated in lung tissues of rats with ALI. The administration of dexamethasone suppressed apoptosis as well as expression of Fas, FasL mRNA and protein, inhibite

7、d TNF- production and abated lung injury. ConclusionsThe excessive apoptosis and Fas/FasL system may play a role in the pathogenesis of LPS-induced ALI in rats. The protective effects of dexamethasone include inhibiting inflammatory mediators production, suppressing the activation of Fas/FasL system

8、 and apoptosis in lung tissues of ALI rats.Key words：Acute lung injury；Endotoxin；Dexamethasone；Apoptosis；Gene expression肾上腺皮质激素具有广泛的抗炎症、抗休克、抗毒素及减少毛细血管渗出等作用，早就应用于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的治疗1。近来的研究表明，地塞米松不仅可抑制TNF-等前炎症细胞因子的表达，而且还可以抑制肺泡上皮细胞凋亡及Fas基因与Fas基因配体(Fas/FasL)的表达2，3。本实验通过观察地塞米松对ALI大鼠肺组织细胞凋亡及Fas、FasL表达的影响，探

9、讨其在全身炎症反应及ALI中的作用机制及意义。材料与方法一、材料健康雄性Wistar大鼠，体重150250 g，54只，由第三军医大学实验动物所提供。大肠杆菌（O111B4）内毒素（LPS），购自美国Sigma公司。细胞凋亡原位检测试剂盒（in situ cell death detection kit, POD）、总RNA提取试剂盒（tripure isolation regent）、寡核苷酸探针3-末端标记试剂盒（dig oligonucleotide 3-end labeling kit）、地高辛检测试剂盒（dig nucleic acid detection kit）均为德国Boehr

10、inger Mannheim公司产品。免疫组化染色SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。兔抗鼠Fas多克隆抗体(M-20,sc-716)、兔抗鼠FasL多克隆抗体(N-20,sc-834)为美国Santa Cruz公司产品。SqRT-PCR试剂购自美国Promega公司。二、主要实验方法1.ALI模型复制：内毒素组大鼠24只，经1%戊巴比妥钠40 mg/kg，腹腔麻醉后，分别行颈动、静脉插管，稳定15 min后、静脉注射LPS 5 mg/kg。注射LPS后进行动脉血气分析，肺脏大体解剖、病理和超微病理符合ALI表现。地塞米松干预组24只，注射LPS 5 mg/ml同时注射地塞米松10 mg/

11、kg。两组大鼠分别在1，2，6，12 h各时相点活杀6只。对照组给予0.1 ml生理盐水,6 h后活杀。 2.肺组织细胞凋亡原位检测采用TUNEL法，按B.M公司试剂盒（POD）提供方法稍加改进进行。计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数,凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示。3.细胞凋亡DNA片段检测参照文献4方法并加以改进。4.肺组织细胞Fas、FasL mRNA表达的原位杂交检测5，采用SqRT-PCR相应下游引物作为寡核苷酸探针。5.半定量逆转录PCR（SqRT-PCR）：引物序列如下：Fas上游引物：5-CAA GGG ACT GAT AGC ATC TTT GAG G

12、-3，下游引物：5-TGT GAA AGT CCA GAA CCC TAA GG-3；FasL上游引物：5-ATC CCT CTG GAA TGG GAA GA-3，下游引物：5-CCA TAT CTG TCC AGT AGT GC-3；-actin上游引物：5-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3，下游引物：5-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3。PCR产物的半定量方法：采用Tiger 920G像分析系统，对RT-PCR产物电泳的Fas（326 bp）、FasL（240 bp）和各自相应的-actin（587 bp）进行扫

13、描、测得其积分光密度值，结果以Fas、FasL积分光密度和相应-actin积分光密度的比值表示。6.免疫组织化学染色步骤，参照试剂盒推荐方法进行。免疫组化对照试验：用正常兔血清或0.01 M PBS代替一抗进行ICC染色, 结果均为阴性。结果判断: 采用Tiger 920细胞像分析仪分析像，在显微镜（×200）下以相同外部条件（亮度）摄取bmp像，每张切片摄10幅，设定灰度值50250。得出统计场总面积的积分光密度值，每张切片取均值。三、统计分析全部数据都以均数±标准差（±s）表示,采用t检验进行统计学处理。结果一、地塞米松对ALI大鼠血清TNF-和肺组织细胞凋亡

14、的影响地塞米松组大鼠血清TNF-水平明显低于LPS致伤的内毒素组各相对应时相点(P<0.01)。与生理盐水对照组相比地塞米松组大鼠肺组织细胞凋亡明显减少（表1）。表1地塞米松对ALI大鼠血清TNF-和肺组织细胞凋亡的影响组别鼠数TNF-（ng/ml）1 h2 h6 h12 h内毒素组245.56± 0.624.81±0.513.720±0.3002.03±0.24生理盐水对照组60.060± 0.020地塞米松组244.49± 0.214.12±0.153.290±0.2101.66±0.24组别鼠

15、数凋亡细胞数(%)1 h2 h6 h12 h内毒素组246.7± 2.115.4±4.527.2±5.831.1±6.3生理盐水对照组61.0± 0.0地塞米松组243.3± 0.46.5±2.16.9±2.47.2±2.3注：与生理盐水对照组比较P<0.01;与相对应时相点内毒素组比较P<0.01 二、DNA电泳结果LPS致伤后2 h肺组织DNA电泳即可出现梯状（Ladder）带，并随LPS作用时间延长，带形逐渐清晰、明显。 地塞米松干预组DNA断裂明显减轻（1）。A: DNA/EcoR+H

16、ind MarkerB:地塞米松组C:LPS 2 h组D: LPS 4 h组E: LPS 6 h组F: LPS 12 h组G: LPS 24 h组1ALI大鼠肺组织DNA电泳三、地塞米松对ALI大鼠肺组织细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响原位杂交结果显示：地塞米松治疗各组肺组织Fas mRNA表达明显低于内毒素致伤组，信号强度与生理盐水对照组相仿。SqRT-PCR结果表明：地塞米松治疗6 h组Fas、FasL mRNA表达水平明显低于内毒素致伤6 h组（P<0.01）,与生理盐水对照组无显著差异(P>0.05)（表2）。表2地塞米松对ALI大鼠Fas、FasL mRNA 表达的影响

17、 组别 鼠数Fas mRNA FasL mRNA 内毒素6 h组60.900±0.120 0.730±0.050生理盐水对照组60.140±0.010 0.040±0.010地塞米松6 h组60.150±0.0100.040±0.010注：与内毒素6小时组比较P<0.01四、免疫组化结果地塞米松治疗各组Fas、FasL蛋白质表达明显减弱，与生理盐水对照组表达水平相近，说明地塞米松可明显抑制ALI大鼠肺组织Fas、FasL蛋白质表达(表3)。表3地塞米松对ALI大鼠Fas、FasL 蛋白质表达的影响组别 鼠数 Fas FasL内毒

18、素6h组64069±542 3981±488内毒素12h组64328±5684205±468内毒素24h组64782±583 4677±487生理盐水对照组6862±112 754±105地塞米松6h组61379±2021265±147 地塞米松12h组 62166±2251899±258地塞米松24 h组 62268±2652144±235注：与生理盐水对照组比较P<0.01;与同时相点内毒素组比较P<0.01讨论我们采用TUNEL法对ALI

19、大鼠肺组织细胞凋亡进行检测，结果发现注射内毒素（LPS）后4 h即可见大鼠支气管上皮、肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡改变； 而对照组未见上述细胞凋亡改变。提示细胞凋亡存在于ALI病程中；细胞凋亡可能参与ALI早期血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损；可能是ARDS时，肺泡水肿、出血、萎陷，导致进行性呼吸困难等临床表现的原因之一。对ALI大鼠肺组织提取DNA后进行电泳分析发现：注射LPS 4 h后即可见肺组织DNA电泳带呈梯状，至6 h更明显。原位杂交结果发现：Fas和FasL mRNA表达在LPS注射后明显上调，在肺泡上皮细胞及间质细胞可见明显的Fas mRNA原位杂交信号。SqRT-PCR结果显

20、示：正常对照组Fas mRNA仅见微弱表达，而FasL mRNA未见表达。注射LPS后，Fas、FasL mRNA表达明显增加，与对照组比较差异有显著性（P<0.01）。免疫组化结果发现：Fas在ALI大鼠肺组织表达明显增加（P<0.01)、呈弥漫性，FasL表达也有一定程度上调。以上结果提示细胞凋亡及相关基因表达异常可能参与ALI的发病机制。肾上腺皮质激素用于ARDS的治疗已有多年，尤其是在早期预防和对晚期肺纤维化的治疗上取得一定的疗效，但也存在争议7。近来的研究表明：皮质激素对LPS诱导的大鼠ALI有明显防护作用，与抑制TNF-、IL-1等炎性细胞因子表达有关8。Wen等2的研

21、究结果显示：地塞米松可抑制由Fas抗体和IFN-诱导的肺泡上皮细胞凋亡。Hagimoto等6采用博莱霉素复制了小鼠ALI和肺纤维化模型，结果显示：甲泼尼龙可明显抑制肺部炎症反应以及肺组织细胞凋亡及Fas、FasL mRNA表达。证实了皮质激素可调控肺组织细胞凋亡。我们的观察结果显示：给予LPS同时给予地塞米松可明显抑制大鼠血清TNF-释放。地塞米松在病程早期（<24 h）可明显抑制LPS 诱导的肺组织细胞凋亡并明显下调Fas、FasL mRNA、蛋白质的表达。我们的实验结果表明，内毒素致伤后，Fas、FasL表达明显上调，且持续时间长，24 h仍有很高水平的表达，并与肺组织损伤程度和肺组

22、织靶细胞凋亡呈平行关系。地塞米松干预组大鼠肺组织Fas、FasL表达较内毒素致伤组显著降低，接近完全抑制，而肺组织损伤和靶细胞凋亡也明显减轻。说明地塞米松可通过抑制Fas/FasL系统活化而阻断、调控肺组织靶细胞凋亡。（作者单位：宋勇(南京，南京军区南京总医院呼吸内科210002)毛宝龄(第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所)钱桂生(第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所)王建春(第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所)参考文献：1Sprung CL,Caralis PV,Marcial EH, et al. The effects of high-dose corticosteroids

23、in patients with septic shock: a prospective, controlled study. N Engl J Med,1984,311:1137-1143.2Wen LP,Madani K,Fahmi JA, et al. Dexamethasone inhibits lung epithelial cell apoptosis induced by IFN- and Fas. Am J Physiol,1997,273,L921-L929.3Hanley ME, Repine JE. Pathogenetic aspects of the adult respiratory dist