脾内移植GM-CSF基因修饰小鼠胎肝细胞对化疗造血损伤的促恢复作用

1、    脾内移植GM-CSF基因修饰小鼠胎肝细胞 对化疗造血损伤的促恢复作用        动物试验证实，经脾脏移植的肝细胞50能够选择性移入肝脏，并在其中较长期存活和有效表达外源基因。我们通过脾内途径移植腺病毒载体GM-CSF基因修饰的胎肝细胞，观察其对化疗造血损伤的恢复影响。 材料和方法1动物与主要试剂BALB/c小鼠，46周龄，C57BL/6孕鼠，孕龄1618天，购自上海必凯实验动物有限公司；荧光标记的大鼠抗小鼠CD34单克隆抗体IgG1购自Gibco；表达小

2、鼠lac Z、小鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因的重组腺病毒Ad LacZ,Ad GM-CSF由日本癌症研究会分子生物治疗研究室Hamada博士惠赠。2小鼠胎肝细胞悬液的制备及体外基因修饰剪碎胎肝于200目镍网过滤，Tris-NH4Cl溶解其中红细胞，按MOI(Mutiple of infection)50分别加入携带mGM-CSF cDNA、对照lac Z cDNA的重组腺病毒，转染2小时后洗2遍，溶于无血清DMEM培养基中，转染效率经X-gal染色证实大于85%。3胎肝细胞脾脏内注射24小时前腹腔注射氟尿嘧啶(150mg/kg)的化疗小鼠在全麻状态下分别脾脏内注射0.2ml

3、 DMEM、胎肝细胞及基因修饰的胎肝细胞（LacZ-FLC，GM-CSF-FLC），覆盖止血明胶并缝合腹膜。4外周血白细胞数检测及血涂片分类计数取小鼠尾静脉血，按常规方法进行白细胞计数及涂片分类计数。5粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的检测于20马血清、20双倍DMEM、20DMEM、2U/mlmGM-CSF和0.3琼脂的培养体系中放入1×105个脾脏有核细胞或0.5×105个骨髓有核细胞，置37, 5CO2 培养箱中培养67天，计数由850个细胞组成的CFU-GM集落数。6CD34细胞的检测通过流式细胞仪进行检测，结果以结合荧光抗体细胞数占总细胞的百分率表示。7统

4、计学处理采用未配对计数资料的t检验。结 果1化疗小鼠外周血白细胞及中性粒细胞数量的变化如1所示，与其它各组相比，GM-CSF基因治疗组白细胞抑制期明显缩短，且下降幅度小（P<0.05），白细胞数量提前56天开始回升；同时，GM-CSF基因治疗组于化疗后69天中性粒细胞比例达到最高(0.30)，而胎肝或Lac Z治疗组中性粒细胞比值与对照组相比，无显著差异(P>0.05)，说明GM-CSF基因疗法对白细胞，特别是中性粒细胞有显著促恢复作用。    1移植GM-CSF-FLC对化疗小鼠白细胞的影响2化疗小鼠脾脏和骨髓CFU-GM水平的变化GM-C

5、SF基因治疗组于化疗后7和14天脾脏CFU-GM形成水平明显高于正常组及各治疗组（7天时，P<0.05; 14天时，P<0.01）；胎肝或Lac Z基因治疗组的脾脏CFU-GM水平亦高于对照组（P<0.05），但升高水平均低于GM-CSF基因治疗组(见2)；而GM-CSF基因治疗组7天和14天的骨髓CFU-GM形成水平与各治疗组相比，未见显著差异。    2移植GM-CSF-FLC对化疗小鼠脾脏CFU-GM的影响3化疗小鼠CD34+细胞含量的变化化疗后第14天GM-CSF基因治疗组小鼠脾脏CD34细胞比例明显高于各治疗组（P<0.

6、05）, 而骨髓中CD34细胞虽有升高，但无统计学差异(附表)。附表脾内移植GM-CSF-FLC对化疗小鼠脾脏和骨髓CD34+细胞含量的影响组别CD34细胞(%)脾脏骨髓正常组2.7±0.444.3±0.74化疗组1.1±0.114.5±0.66化疗+DMEM组1.4±0.203.9±0.50化疗+FLC组1.2±0.134.0±0.47化疗+LacZ-FLC组1.5±0.134.3±0.39化疗+GM-CSF-FLC组2.9±0.414.7±0.72  

7、   讨 论本研究表明，脾内移植GM-CSF基因修饰的小鼠胎肝细胞不仅能促进外周血白细胞数目提前恢复，尚能提高中性粒细胞比例，特别是在白细胞降至最低点时中性粒细胞比例最高，达29%，有助于宿主度过致命的感染期。Aglietts等1研究发现，患者体内直接注射GM-CSF因子，停用72小时后升高的白细胞数目可反跳性降低，甚至低于正常水平；而GM-CSF基因疗法通过在体内恒定的GM-CSF分泌，避免了大剂量GM-CSF直接注射后的负反馈现象。探讨GM-CSF基因疗法促进造血恢复的机制，发现脾内移植GM-CSF基因修饰的FLC不仅能显著促进小鼠脾脏CFU-GM、CD34+细胞数目的

8、恢复及提高，有效刺激机体以粒单系为主的造血前体细胞分化、成熟，尚能通过GM-CSF的体内表达与T淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及巨噬细胞上相应受体结合，刺激机体内源性GM-CSF、G-CSF及M-CSF等造血因子产生，进一步增强了GM-CSF基因疗法的造血刺激作用。但实验中我们亦观察到GM-CSF基因疗法不能减轻化疗对骨髓早期造血功能毒性的影响，这与Schwartz等2应用GM-CSF细胞因子疗法的发现相一致，可能与GM-CSF促进化疗后骨髓前列腺素(PGE2或PGF2)的合成，从而下调骨髓造血有关，而联合应用PG合成抑制剂可逆转前列腺素对骨髓的造血抑制作用。本课题受军队九五重点基金（96Z

9、032）资助作者单位: 200433上海， 第二军医大学免疫学教研室（弭静、曹雪涛、王全兴、于益芝、张明徽）; 山东医科大学附属医院消化内科（袁孟彪）参 考 文 献1Aglietts M, Monzeglio C, Pasquino P, et al. Short-term administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor decreases hematopoietic toxicity of cytostatic drugs. Cancer, 1993,72:2970-2973.2Schwartz GN, Hakim F, Zuiewski J, et al. Early suppressive effects of ch