基因表达检测

1、基因表达水平的检测基因表达水平的检测苏苏 川川南京医科大学病原生物学系南京医科大学病原生物学系 86862774江苏省病原生物学重点实验室江苏省病原生物学重点实验室 86862773一、基因表达的概述：一、基因表达的概述： 从基因到蛋白质从基因到蛋白质中心法则：中心法则： DNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录逆转录逆转录翻译翻译复制复制2. 教学目的：教学目的：了解检测基因表达主要方法的原理及大概操了解检测基因表达主要方法的原理及大概操作要点作要点理解各检测方法的优缺点理解各检测方法的优缺点懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合理解释理解释二、基因表达调控的

2、基本概念与原理：二、基因表达调控的基本概念与原理： 基因表达调控的概念及方式：基因表达调控的概念及方式：基因：基因：一个遗传单位，是一段可表达的一个遗传单位，是一段可表达的DNA序列。序列。基因组：基因组：一个单倍体细胞或病毒颗粒的全套基因。人类基因一个单倍体细胞或病毒颗粒的全套基因。人类基因组含约组含约4万个基因。万个基因。基因表达：基因表达：基因所包含的遗传信息通过转录生成基因所包含的遗传信息通过转录生成RNA，再，再经过翻译生成蛋白质的过程。一般而言，在某一特定时刻，经过翻译生成蛋白质的过程。一般而言，在某一特定时刻，高等生物仅有不到高等生物仅有不到15%的基因表达。的基因表达。基因表达

3、调控：基因表达调控：基因表达有其特定的规律，并受到机体各种基因表达有其特定的规律，并受到机体各种因素的调节和控制。对基因的表达实施精确的控制，使细胞因素的调节和控制。对基因的表达实施精确的控制，使细胞适应不同阶段、不同环境条件下的生长与发育的需要，维持适应不同阶段、不同环境条件下的生长与发育的需要，维持机体正常生命活动，有着重要意义。机体正常生命活动，有着重要意义。可诱导基因：基因表达的时间特异性可诱导基因：基因表达的时间特异性 基因表达的空间特异性（组织特异性）基因表达的空间特异性（组织特异性）看家基因看家基因:2. 基因表达调控的基本原理：基因表达调控的基本原理：原核生物和真核生物的基因表

4、达调控尽管在细节上差异原核生物和真核生物的基因表达调控尽管在细节上差异很大，但两者的调控模式和原理极为相似。很大，但两者的调控模式和原理极为相似。调节作用主要包括核酸之间的相互作用、核酸与蛋白质调节作用主要包括核酸之间的相互作用、核酸与蛋白质之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。调控作用可能是正向的或负向的。调控作用可能是正向的或负向的。调控点可以位于基因表达过程的各个环节，如基因的激调控点可以位于基因表达过程的各个环节，如基因的激活、转录起始、转录后加工、活、转录起始、转录后加工、mRNA降解、蛋白质翻译、降解、蛋白质翻译、翻译后加工和蛋白质降解等。

5、翻译后加工和蛋白质降解等。特异特异DNA序列对基因表达的影响：序列对基因表达的影响：真（原）核生物真（原）核生物DNA分子上的特定序列构成了基因表达的基分子上的特定序列构成了基因表达的基本信号：起始密码、调控序列、编码序列、终止密码、单拷贝本信号：起始密码、调控序列、编码序列、终止密码、单拷贝序列、重复序列等。序列、重复序列等。DNA与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：DNA上的特定序列可以与相应的蛋白质结合，这些蛋白质依其作用分上的特定序列可以与相应的蛋白质结合，这些蛋白质依其作用分为：为：阻遏蛋白（阻遏蛋白（repressor）：与操纵序列结合，阻遏

6、基因的转录。）：与操纵序列结合，阻遏基因的转录。激活蛋白（激活蛋白（activator）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。特异因子特异因子转录因子（转录因子（transcription factor, TF）也称反式作用因子（）也称反式作用因子（trans-acting factor）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性DNA-蛋白质之间的结合通常是非共价键的形式，通过蛋白质分子中特蛋白质之间的结合通常是非共价键的形式，通过蛋白质分子中特殊的结构域与殊的结构域与DNA分子中双螺旋结构的大沟结合，调节基因的转录

7、。分子中双螺旋结构的大沟结合，调节基因的转录。常见的常见的DNA-蛋白质结合域有：蛋白质结合域有：螺旋转角螺旋（螺旋转角螺旋（helix-turn-helix）锌指（锌指（zinc fingers）蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：调节蛋白通常通过二聚体（调节蛋白通常通过二聚体（dimer）或多聚体（）或多聚体（polymer）的形）的形式与式与DNA结合结合不同的调节蛋白也可以相互作用或结合后，再与不同的调节蛋白也可以相互作用或结合后，再与DNA特定部位特定部位结合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生物。结合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多

8、见于真核生物。蛋白质之间相互作用的典型特征包括：蛋白质之间相互作用的典型特征包括：亮氨酸拉链（亮氨酸拉链（leucine zipper）螺旋转角螺旋（螺旋转角螺旋（helix-loop-helix）RNA聚合酶对基因表达的影响：聚合酶对基因表达的影响：转录起始是通过转录起始是通过RNA聚合酶与启动子的结合来实现的，转录聚合酶与启动子的结合来实现的，转录起始的调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。起始的调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。不同启动子的序列不同，因而影响它们与不同启动子的序列不同，因而影响它们与RNA聚合酶结合的聚合酶结合的亲和力，亲和力的不同继而直接影响转录

9、起始的频率。亲和力，亲和力的不同继而直接影响转录起始的频率。RNA聚合酶和启动子的结合也会受到调节蛋白的影响聚合酶和启动子的结合也会受到调节蛋白的影响,阻遏蛋阻遏蛋白、激活蛋白、特异因子、转录因子等均可通过增强或者干扰白、激活蛋白、特异因子、转录因子等均可通过增强或者干扰RNA聚合酶与启动子之间的结合，调节基因的起始。聚合酶与启动子之间的结合，调节基因的起始。三、原核生物的基因表达调控：三、原核生物的基因表达调控： 原核生物结构简单、无细胞核，转录和翻译过程耦联在一起，原核生物结构简单、无细胞核，转录和翻译过程耦联在一起，对环境条件的变化反应迅速，可以根据环境因素的变化迅速对环境条件的变化反应

10、迅速，可以根据环境因素的变化迅速调整自身基因的表达，满足其生长和繁殖的需要。原核基因调整自身基因的表达，满足其生长和繁殖的需要。原核基因表达调控的特点为：表达调控的特点为：普遍存在操纵子调控模式普遍存在操纵子调控模式通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录转录与翻译的耦联转录与翻译的耦联转录水平的调控：转录水平的调控：乳糖操纵子的调控：乳糖操纵子的调控：阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节2） 其它转录调控机制：其它转录调控机制：转录衰减：转录衰减：基因重组：基因重组：翻译水平的调控：翻译水平的调控：SD序列对翻译的影响：序列对翻译的

11、影响：SD序列是原核生物序列是原核生物mRNA起始密码子起始密码子AUG上游上游3-10碱基的由碱基的由3-9个碱基组成的一个富含嘌呤核苷酸的序个碱基组成的一个富含嘌呤核苷酸的序列，能与核糖体小亚基列，能与核糖体小亚基16s rRNA3末端富含嘧啶的序列互补，从末端富含嘧啶的序列互补，从而使核糖体与而使核糖体与mRNA结合，开始翻译。结合，开始翻译。mRNA的稳定性：原核细胞内的稳定性：原核细胞内mRNA通常很快被降解。例如：通常很快被降解。例如：E. coli的许多的许多mRNA在在37时的平均寿命只有大约时的平均寿命只有大约2分钟。分钟。翻译产物对翻译的影响：有些翻译产物对翻译的影响：有些

12、mRNA编码的蛋白质，本身就是在编码的蛋白质，本身就是在蛋白翻译过程中发挥作用的因子。这些因子可对自身的翻译产生蛋白翻译过程中发挥作用的因子。这些因子可对自身的翻译产生调控作用。如起始因子调控作用。如起始因子3（IF-3），当它合成过多时，能有效地校），当它合成过多时，能有效地校正和抑制其自身的起始密码子与起始正和抑制其自身的起始密码子与起始tRNA的配对而抑制翻译的的配对而抑制翻译的起始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。起始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。四、真核生物的基因表达调控：四、真核生物的基因表达调控：真核生物基因表达调控与原核不同点在于：真

13、核生物基因表达调控与原核不同点在于：转录激活与染色体转录区特定结构相适应转录激活与染色体转录区特定结构相适应正性调节占主导正性调节占主导转录与翻译在空间上的分离转录与翻译在空间上的分离1.1. 更多、更复杂的调控蛋白更多、更复杂的调控蛋白（一）、DNADNA水平的调控（真核生物表达调控的次水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：要和辅助手段）：染色质（染色质（chromatin）结构对基因表达的调控作用：）结构对基因表达的调控作用：真核基因通常与组蛋白（真核基因通常与组蛋白（histone）结合形成核小体，从而保护）结合形成核小体，从而保护DNA免受损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达

14、。影响基因免受损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达。影响基因表达水平的主要有：表达水平的主要有： 组蛋白的含量组蛋白的含量 组蛋白的结构组蛋白的结构 调节蛋白与组蛋白调节蛋白与组蛋白H1和和H5竟争和竟争和DNA的结合，从而解除的结合，从而解除组蛋白对基因表达的抑制作用。组蛋白对基因表达的抑制作用。基因修饰对基因表达的调控作用：基因修饰对基因表达的调控作用：胞嘧啶经甲基化为胞嘧啶经甲基化为5-甲基胞嘧啶（常出现在甲基胞嘧啶（常出现在5端侧翼序列的端侧翼序列的GC丰富区），影响丰富区），影响DNA特异序列与转录因子的结合，使基因不能特异序列与转录因子的结合，使基因不能转录或阻止转录复合物的形成。

15、转录或阻止转录复合物的形成。基因丢失：基因丢失：在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。些基因的活性。染色体破碎所致的不均等分配。染色体破碎所致的不均等分配。仅发生在低等生物中（原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动仅发生在低等生物中（原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。基因扩增：基因扩增：细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是细胞在短期内为满足某种需要（发育需要、外界环境它是细胞在短期内为

16、满足某种需要（发育需要、外界环境因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。 基因重排：基因重排：基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一种熟知的以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免种熟知的以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接：疫球蛋白各编码区的连接：一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。轻

17、链：可变区、恒定区、连接区都由位于同一染色体不同轻链：可变区、恒定区、连接区都由位于同一染色体不同位置的位置的DNADNA片段编码，在形成活性基因前，上述各一个基因片段编码，在形成活性基因前，上述各一个基因通过染色体内重组成连到一起。通过染色体内重组成连到一起。重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区（二）、转录水平的调控：（二）、转录水平的调控： 转录水平的调控是真核基因表达调控中转录水平的调控是真核基因表达调控中最重要最重要的环节，的环节，大多数生物基因在转录水平的调控是决定细胞质中大多数生物基因在转录水平的调控是决定细胞质中mRNAmRNA水平的一个最重要

18、方式，调控主要通过反式作用水平的一个最重要方式，调控主要通过反式作用因子和因子和RNARNA聚合酶的相互作用来实现。聚合酶的相互作用来实现。 反式作用因子反式作用因子是一类细胞核内存在的蛋白质，是与特异的是一类细胞核内存在的蛋白质，是与特异的DNADNA序列（顺式作用元件）结合的调控蛋白。它通过识别并结合上游序列（顺式作用元件）结合的调控蛋白。它通过识别并结合上游启动子元件和增强子中的顺式元件，激活或阻遏基因的表达。它启动子元件和增强子中的顺式元件，激活或阻遏基因的表达。它包括三个功能域：包括三个功能域： DNADNA识别结合域（常有锌指结构）识别结合域（常有锌指结构） 转录活性域（富含某些特

19、定氨基酸如谷氨酰氨）转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨） 蛋白质相互作用结构域（常具有亮氨酸拉链结构和螺旋蛋白质相互作用结构域（常具有亮氨酸拉链结构和螺旋环螺旋结构等）。环螺旋结构等）。转录起始复合物转录起始复合物: :转录起始复合物的形成过程有三步：转录起始复合物的形成过程有三步：TATATATA因子结合因子结合TATATATA盒（形成盒（形成TATATATA因子因子DNADNA复合物）复合物）RNA polRNA pol识别并结合识别并结合TATATATA因子因子DNADNA复合物（闭合复合物，复合物（闭合复合物，DNADNA双链没有打开，不能启动转录）双链没有打开，不能启动转录）转

20、录起始因子与转录起始因子与RNA polRNA pol结合，形成转录起始复合物结合，形成转录起始复合物（开放复合物，（开放复合物，DNADNA双螺旋已打开，可以合成双螺旋已打开，可以合成RNARNA）转录起始的调控：转录起始的调控：基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和件和RNARNA聚合酶的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因聚合酶的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。子的激活及反式作用因子的作用等。反式作用因子的活性调节：反式作用因子的活性调节：表达调节：迅速合成、迅速降解表达调节

21、：迅速合成、迅速降解共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）蛋白质与蛋白质相互作用：蛋白质与蛋白质相互作用：maxmax蛋白蛋白c-mycc-myc蛋白（核内蛋白（核内的反式作用因子）的反式作用因子）反式作用因子与顺式元件结合的调节：反式作用因子与顺式元件结合的调节：顺式作用元件包括：顺式作用元件包括： 上游启动子元件上游启动子元件 远距离的增强子元件（上游增强子元件、下游增强远距离的增强子元件（上游增强子元件、下游增强子元件）子元件）反式作用因子作用方式的调节：反式作用因子作用

22、方式的调节：反式作用因子通过下列不同的方式作用到反式作用因子通过下列不同的方式作用到RNARNA聚合酶结合聚合酶结合位点从而影响其转录活性：位点从而影响其转录活性： 成环成环 扭曲扭曲 滑动滑动 连锁反应连锁反应反式作用因子的组合式调节：反式作用因子的组合式调节：几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。（三）、转录后水平的调控：（三）、转录后水平的调控： 转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列修饰、加工过程，主要包括进行一系列修饰、加工过程，主要包括mRNAmRNA选择性选择性剪切、胞内

23、定位以及剪切、胞内定位以及mRNAmRNA稳定性调节：稳定性调节： DNADNA（核内）（核内）转录转录 mRNAmRNA前体前体 加工加工成熟成熟mRNAmRNA 运输运输细胞质细胞质 mRNAmRNA前体加帽、加尾以调控其稳定性：前体加帽、加尾以调控其稳定性：55加帽（加帽（cappingcapping）：）：7 7甲基鸟苷三磷酸甲基鸟苷三磷酸33端加尾（端加尾（tailingtailing）：多聚）：多聚A A（Poly APoly A）mRNAmRNA前体的选择性剪接（前体的选择性剪接（splicingsplicing）与拼接：）与拼接：选择性剪切：去除选择性剪切：去除mRNAmRNA

24、前体中的内含子前体中的内含子选择性拼接：从同一基因产生若干种有部分相同结选择性拼接：从同一基因产生若干种有部分相同结构的蛋白质，即通过构的蛋白质，即通过MrnauMrnau前性的选择性拼接而产前性的选择性拼接而产生不同的成熟生不同的成熟mRNAmRNA，然后翻译成不同的蛋白质。，然后翻译成不同的蛋白质。选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定的细胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件的细胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性的表达。下选择性的表达。 RNA编辑的调控：编辑的调控：RNA编辑（编辑（editing）：是指转录后的）：是指

25、转录后的mRNA前体在前体在编码区发生核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序编码区发生核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括：列不同的蛋白质。包括：核苷酸的替换核苷酸的替换核苷酸的插入或缺失核苷酸的插入或缺失mRNA转运的调控：转运的调控：mRNA前体经过加帽、加尾、剪切等加工后通过核膜孔从核前体经过加帽、加尾、剪切等加工后通过核膜孔从核内运至胞浆。内运至胞浆。大约只有大约只有20%的的mRNA进入胞浆，留在核内的进入胞浆，留在核内的mRNA约约50%会在会在1小时内降解。小时内降解。（四）、翻译水平的调控： 翻译水平的调控主要是控制翻译水平的调控主要是控制mRNAmRNA的稳

26、定性和的稳定性和mRNAmRNA翻译的起始频翻译的起始频率，是一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采率，是一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采用的调控方式。用的调控方式。mRNAmRNA的稳定性，取决于：的稳定性，取决于：mRNAmRNA的二级结构（不易受外切酶攻击）的二级结构（不易受外切酶攻击）帽子及其种类帽子及其种类polyApolyA尾的长短尾的长短与与mRNAmRNA结合的蛋白质的种类结合的蛋白质的种类mRNAmRNA翻译起始的调控（即控制翻译起始的调控（即控制mRNAmRNA的可翻译性）：的可翻译性）：许多蛋白质因子可以影响蛋白质合成的起始，如真核生物起始因许多

27、蛋白质因子可以影响蛋白质合成的起始，如真核生物起始因子子2 2（eukaryotic initiation factoreukaryotic initiation factor，eIF-2eIF-2）的磷酸化会使）的磷酸化会使其活性降低，从而减少蛋白质合成。其活性降低，从而减少蛋白质合成。Recruitment factorRecruitment factor可使可使masked mRNAmasked mRNA与核糖体、氨酰基与核糖体、氨酰基-tRNA-tRNA、蛋白质结合。蛋白质结合。真核生物蛋白质合成的自体调控：真核生物蛋白质合成的自体调控：某些蛋白可抑制其自身某些蛋白可抑制其自身mRNA

28、mRNA的翻译的翻译 （五）、翻译后水平的调控：mRNA翻译的产物新生多肽链大多是没有生物翻译的产物新生多肽链大多是没有生物学活性的，必须经过加工、修饰才能成为有活性的学活性的，必须经过加工、修饰才能成为有活性的蛋白质，加工、修饰过程包括：蛋白质，加工、修饰过程包括：信号肽的切除：由信号肽的切除：由1530个疏水氨基酸组成的信个疏水氨基酸组成的信号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。酰化等。1.肽链的剪切与正确折叠肽链的剪切与正确折叠五、蛋白表达水平的检测方法及选择

29、五、蛋白表达水平的检测方法及选择DNA水平的检测：水平的检测：Southern blotPCRDNA测序测序蛋白质表达水平的检测：蛋白质表达水平的检测：SDSPAGE与与Western blotELISA流式细胞仪（流式细胞仪（FACS）检测）检测免疫组化免疫组化蛋白质芯片蛋白质芯片mRNA水平的检测：水平的检测：Northern blot基因芯片基因芯片Nuclei run-on原位杂交原位杂交RT-PCR实时荧光定量实时荧光定量RTPCR半定量半定量RTPCRSouthern Blot原理：原理：DNADNA杂交杂交操作过程：操作过程：基因组基因组DNA经过一种或多种限制性内切酶消化经过一

30、种或多种限制性内切酶消化消化后的消化后的DNA片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳按照大小片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳按照大小进行分离进行分离DNA经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为尼龙膜或硝酸纤维素膜）尼龙膜或硝酸纤维素膜）变性的变性的DNA可以与标记的可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交或寡核苷酸探针杂交通过特定的检测方法（如放射自显影）来确定与探针互补的通过特定的检测方法（如放射自显影）来确定与探针互补的带的位置；或通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使带的位置；或通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使用的）消化过的基因组

31、用的）消化过的基因组DNA产生的带的大小及数量的估计产生的带的大小及数量的估计来判断结果来判断结果 重物（重物（400克）克）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶滤纸滤纸滤纸桥滤纸桥尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛细管转移示意图上行毛细管转移示意图Polymerased Chain Reaction (PCR)原理：原理：高温下双链高温下双链DNA变性为单链变性为单链DNA低温下单链低温下单链DNA与引物寡核苷酸复性与引物寡核苷酸复性中温下由中温下由DNA聚合酶进行互补链的修复复聚合酶进行互补链的修复复制过程制过程2. 方法方法10 X 反应缓冲液：反应缓冲液： PH

32、8.8-8.3Mg2+ 0.5-5.0mmol/L，K+ 50-100mmol/L，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）模板模板DNA引物（引物是引物（引物是PCR反应成功与否的关键之一）反应成功与否的关键之一）上游引物上游引物下游引物下游引物TaqDNA聚合酶聚合酶ddH2O95 C 1min55 C 1min72 C 1min4 C 35XDNA 序列测定Sanger双脱氧未端终止法测序原理：双脱氧未端终止法测序原理： 聚合酶扩增：聚合酶扩增：PCR扩增的同时在部分产物末端掺入四色荧光标扩增的同时在部分产物末端掺入四色荧光标记的四种记的四种ddNTPs电泳分离、激光读序电泳

33、分离、激光读序 ABI 377全自动测序仪进行全自动测序仪进行DNA核苷酸序列测定核苷酸序列测定方法：方法： 引物准备：引物准备：纯度：须事先用纯度：须事先用PAGE胶纯化过胶纯化过浓度：配制成浓度：配制成5-10pmol/uL5-10pmol/uL 模板准备：模板准备： 纯度：推荐使用试剂盒进行纯化纯度：推荐使用试剂盒进行纯化 模板量：模板量：PCR产物产物 100-200bp 2-4ng 单链单链 50-100ng 200-500bp 4-10ng 双链双链 200-500ng 500-1000bp 6-20ng 粘粒、粘粒、BAC 0.5-1ug 1000-2000bp 10-40ng

34、细菌基因组细菌基因组DNA 2-3ug 2000bp 80-2000ng测序测序PCR：用于：用于PCR产物，单、双链产物，单、双链 加样：加样： Terminator Ready Reaction Mix 8.0ul模板模板 不定量不定量引物引物 3.2pmolddH2O 不定量不定量 合计合计 20ul 反应：反应：96 C 10sec50 C 5sec60 C 4min4 C 70X纯化测序产物：纯化测序产物： 加加50ul 95%乙醇，混匀乙醇，混匀 置室温（置室温（25度）度）15分钟，分钟，12000g离心离心20分钟，弃上清分钟，弃上清 加加150ul 75%乙醇洗乙醇洗1-2次

35、，同上离心次，同上离心10分钟。分钟。 弃上清，抽干。弃上清，抽干。制备测序电泳用制备测序电泳用PAGPAG变性胶变性胶 预电泳（预电泳（Pre-runPre-run） 电泳电泳数据分析数据分析 SDSPAGE与与Western blot(蛋白凝胶电泳及免疫印迹法蛋白凝胶电泳及免疫印迹法)原理：原理：确保蛋白质解离为单个多肽确保蛋白质解离为单个多肽亚基（亚基（SDS）通过分离胶的筛分作用，将通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离不同得到分离将蛋白质固定于尼龙膜上将蛋白质固定于尼龙膜上以抗体识别待检蛋白（抗原）以抗体识别待检蛋白（抗原）固定物1Ab2

36、AbE 蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）2. 操作过程操作过程样品制备：样品制备：收集细胞收集细胞PBS洗涤并离心沉淀细胞洗涤并离心沉淀细胞加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟分钟高速离心，取上清（蛋白溶液）高速离心，取上清（蛋白溶液）加入等量加入等量2XSDSPAGE样品缓冲液样品缓冲液煮沸煮沸5分钟后上样（或保存于分钟后上样（或保存于20）制胶（不连续缓冲胶系统）：制胶（不连续缓冲胶系统）：胶的成份：胶的成份：压缩胶压缩胶分离胶分离胶胶浓度的选择：胶浓度的选择：丙烯酰氨浓度丙烯酰氨浓度蛋白线性分离范围蛋白线性分离范围/KDa1512107.5510431

37、2602080369457212加样与电泳：加样与电泳：加适量的样品（加适量的样品（2001000ug总蛋白量）、对照及蛋白总蛋白量）、对照及蛋白分子量分子量marker180200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳电泳装置）装置）凝胶染色：凝胶染色：考马斯亮蓝（考马斯亮蓝（R250）染色）染色银染银染印迹转移：印迹转移：原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上结合到膜上4条件下，条件下，30

38、0mA电泳电泳13小时（小时（Bio-Rad电泳装置）电泳装置）封闭：封闭：5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA，室温下，室温下1小时（或小时（或4过夜）过夜）一抗反应：一抗反应：选择合适的第一抗体选择合适的第一抗体适量抗体以适量抗体以5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA稀释稀释室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应二抗反应：二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以适量抗体以5%脱脂牛奶或脱脂牛奶或5%BSA稀释稀释室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应加生色底物显色加生色底物显色HRP的底物：的底物：生色：生色：4氯氯1

39、萘酚萘酚/H2O2发光：发光：ECL溶液（鲁米诺溶液（鲁米诺/4碘代酚碘代酚/ H2O2 ）AP的底物：的底物：生色：氮蓝四唑生色：氮蓝四唑/5溴溴4氯吲哚磷酸氯吲哚磷酸发光：发光：AMPPD拍片或曝光、洗片拍片或曝光、洗片0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrp53p21-TubulinTime after irradiationDNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest优缺点：优缺点：优点：优点：不须纯化而

40、直接反映其中单个蛋白表达水平的变化不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实实验简单可靠、重复性好实验简单可靠、重复性好缺点：缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程不能反映蛋白质变化的中间过程灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化的变化对抗体的依赖度高对抗体的依赖度高应用应用：直接检测蛋白质的有无、变化直接检测蛋白质的有无、变化可直接检测部分蛋白的功能可直接检测部分蛋白的功能与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用与其它方法结合后，可检测

41、蛋白蛋白相互作用酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：原理：将 可 溶 性 蛋 白 质将 可 溶 性 蛋 白 质（单一组分或混合（单一组分或混合组分）固定于酶标组分）固定于酶标板壁上板壁上抗原或抗原或抗体抗体检测待检蛋白检测待检蛋白抗体或抗原抗体或抗原固定物1Ab2AbE 蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）2. 操作过程（间接法、双抗体夹心法）操作过程（间接法、双抗体夹心法）样品处理：样品处理：已知样品必须是可溶性蛋白溶于已知样品必须是可溶性蛋白溶于PBS、水等、水等样品可以是单一组分或混合组分样品可以是单一组分或混合组分包板：包板：适量的抗原以高适量的抗原以高PH溶液（溶液（PH7

42、.67.8的碳酸盐缓冲液）或的碳酸盐缓冲液）或低低PH溶液（溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板4反应反应12天天PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期保存洗涤后，即可使用该板或可较长期保存封闭：封闭：4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA，室温下，室温下1小时（或小时（或4过夜）过夜）一抗反应：一抗反应：选择合适的第一抗体选择合适的第一抗体适量抗体以适量抗体以4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA稀释稀释室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应二抗反应：二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以适量抗

43、体以4%脱脂牛奶或脱脂牛奶或4%BSA稀释稀释室温下室温下1小时（或小时（或4过夜）反应过夜）反应加生色底物显色：加生色底物显色：HRP的底物：的底物： H2O2/TMB终止：终止：2M H2SO4结果判断：结果判断：目测法目测法仪器法仪器法优缺点：优缺点：优点：优点：用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实方法简单（多样）、快速方法简单（多样）、快速可大批量检测标本可大批量检测标本敏感性较高敏感性较高缺点：缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程不能反映蛋白质变化的中间过程多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化多用于检测细胞表达量较大的可溶

44、性蛋白质的变化特异性相对较低，重复性相对较差特异性相对较低，重复性相对较差对所用抗体的依赖度高对所用抗体的依赖度高应用应用：大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化What is Flow Cytometry? Flow Cytometry is a powerful technique for cell counting, sorting and surface marker analyzing Flow Cytometry can provide quantitative information about cell surface markers

45、Based on immunofluorescence technique and computer-aided analysis流式细胞仪（流式细胞仪（FACS）检测）检测原理：基于单个细胞水平的检测原理：基于单个细胞水平的检测Fluorescence-activated cell sorter (FACS) FACS is one version of Flow Cytometry, which can sort cells by their surface markers Individual cell is positively or negatively charged based

46、on their fluorescence color When charged cells pass through an electric field, they are deflected and hence separated2. FASC的应用：的应用：细胞表面标志细胞表面标志细胞组分：细胞组分：DNA含量含量RNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量细胞动力学参数细胞动力学参数细胞增殖细胞增殖细胞凋亡细胞凋亡细胞分化细胞分化其它：其它：白血病免疫分型白血病免疫分型造血干细胞造血干细胞血小板血小板机体免疫功能机体免疫功能各种基因各种基因v癌基因和抑癌基因癌基因和抑癌基因v调节基因调节基因v肿

47、瘤转移相关基因肿瘤转移相关基因v多药耐药基因多药耐药基因Use Flow Cytometry to examine CD4 and CD8 expression during T cell maturationTreat T cell population with anti-CD4 monoclonal antibody (coupled with dye 1) and anti-CD8 monoclonal antibody (coupled with dye 2) at different maturation stages, then subject the cell populati

48、on to FACS. Flow Cytometry dot plots will be generated.0.111010010000.11101001000dye 1 intensity(for CD4)dye 2 intensity(for CD8)Double Negative(CD4-,CD8-)Doublepositive(CD4+,CD8+)Singlepositive(CD4-,CD8+)Singlepositive(CD4+,CD8-)die T cell(CD4-,CD8-)die0 200 400 600 8001000DNA contentCount Purdue U

49、niversity Cytometry Laboratories4 hr, control28 hr, irradiatedG1: 94.1%S: 1.5%G2/M: 4.4%G1: 94.1%S: 1.1%G2/M: 4.8%G1: 60.6%S: 34.9%G2/M: 4.5%G1: 96.6%S: 1.6%G2/M: 1.8%10%1%90%4%28 hr, control28 hr, aphidicolin 免疫组织化学法免疫组织化学法原理：原理：组织细胞内蛋白质等组分被原位固定组织细胞内蛋白质等组分被原位固定以特异性抗体识别待检蛋白并显色以特异性抗体识别待检蛋白并显色方法：方法：组织

50、细胞固定：组织细胞固定：4%多聚甲醛，多聚甲醛，RT 10min通透性处理：通透性处理：0.5%Triton-X100，RT 10min封闭：封闭：5%马血清、马血清、5%羊血清等，羊血清等，37C 15min一抗：关键一抗：关键二抗：荧光标记二抗：荧光标记封片，观察封片，观察WI38MRC5VA13U2OSHelaSAOS2NPAT concentrates at a few foci in the nuclei of human cellsG0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCell cycle-dependent change of NPAT loci in WI38

51、cellsFigure 7: IR-induced dispersion of NPAT protein from histone gene loci depends on p53 and p21.Figure 8: Inhibition of Cdk2 activity prevents NPAT foci formation.优缺点：优缺点：优点：不仅可以定性，更重要的是可以定位优点：不仅可以定性，更重要的是可以定位缺点：缺点： 无法检测表达量低的蛋白质无法检测表达量低的蛋白质 难以定量难以定量 高度依赖于抗体高度依赖于抗体 操作过程比较复杂操作过程比较复杂应用：应用：蛋白定位蛋白定位 在

52、哪里？在哪里？ 去哪里？去哪里？其它其它Northern Blot原理：原理：将将RNA固定于尼龙膜上固定于尼龙膜上以以DNA探针识别待检探针识别待检mRNA尼尼 龙龙 膜膜AEDCBRNABBB同位素标记的同位素标记的DNA探针探针2. 操作过程操作过程总总RNA提取：提取：用用Rneasy Mini Kit抽取总抽取总RNA （QIAGEN公司）公司）用用700ul SW1洗一次洗一次用用500ul RPE洗洗2次次用用50ul RNase free ddH2O洗脱两次洗脱两次取取2ul加入加入98ul ddH2O，测取，测取OD260/280并计算并计算RNA浓度及浓度及总总RNA得量得

53、量制胶（变性制胶（变性11.5%Agarose胶）：胶）：制备制备100ml含有含有2.2mol/L甲醛的甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶，加的琼脂糖凝胶，加1.5克琼脂糖凝胶粉到克琼脂糖凝胶粉到72ml灭菌水中，煮沸溶解后置灭菌水中，煮沸溶解后置55水浴，水浴，均衡后均衡后10ml MOPS电泳缓冲液和电泳缓冲液和18ml去离子甲醛，在化学去离子甲醛，在化学通风橱内灌胶通风橱内灌胶加入足够量的加入足够量的1XMOPS电泳缓冲液，预电泳约电泳缓冲液，预电泳约5分钟。备用。分钟。备用。RNA样品预处理：样品预处理：在一灭菌在一灭菌EP管中建立变性反应：管中建立变性反应：RNA（多达（多达20ug）2.

54、0 ul10XMOPS电流缓冲液电流缓冲液2.0 ul甲醛甲醛4.0 ul甲酰氨甲酰氨10.0ul溴化乙淀溴化乙淀1.0 ul6520分钟变性，立即置冰上分钟变性，立即置冰上10分钟分钟简短离心后备用简短离心后备用电泳：电泳：上样：等量总上样：等量总RNA/样品样品45volts/cm电泳电泳57小时。小时。不能用过高的电压！不能用过高的电压！转移：转移：经典方法：搭建经典方法：搭建“金字塔金字塔”，转移过夜。，转移过夜。 重物（重物（400克）克）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶滤纸滤纸滤纸桥滤纸桥尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持物支持物20XSSC上行毛细管转移示意图上行毛细管转移示意

55、图DNA探针的制备：探针的制备：在一灭菌在一灭菌EP管中建立反应：管中建立反应：2.0ul模板模板GAPDH PCR产物（产物（150bp,100ng/ul）6.0ul10 X EcoPol buffer6.0uldNTPs（无（无dCTP）3.0ul5-GAPDH(100ng/ul)3.0ul3-GAPDH(100ng/ul)31.0ul ddH2O煮沸煮沸10分钟，立即置冰上分钟，立即置冰上10分钟：分钟：加入：加入：2.5ulKlenow6.5ul32P-dCTP室温下孵育室温下孵育6小时小时过柱纯化已标记探针（过柱纯化已标记探针（Phamarcia试剂盒）试剂盒）取相等取相等CPM量量

56、RNA，加入，加入2ml TES/0.6M NaCL10mM TES10mM EDTA0.2%SDS在杂交炉中，在杂交炉中，68反应过夜反应过夜用用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次用用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次洗膜三次曝光于曝光于X光胶片光胶片Crosslink预杂交预杂交加入加入10ml杂交混合液，杂交混合液， 68反应反应45分钟分钟杂交杂交H2AH3H4GAPDH0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationC.H2BH102040608010012002468101214time after ir

57、radiation (hr)% controlS phaseH1H2AH2BH3H4DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrestHCT116（p53+/+,p21+/+)D.E.0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hrH2AH4GAPDHTime afer GFP-p21 inductionH1H2BH30204060801000246810121424Hour after GFP-p21 inducti

58、on% controlS phaseNPAT fociH1H2AH2BH3H4Inhibition of CDK activity disperses NPAT from histone gene promoters and down-regulates histone gene expressionA.0204060801001200468101214Time after irradiation (hr)% controlS phaseH1H2AH2BH4H2AH4GAPDHH2BH10 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationH

59、CT116（p53-/-,p21+/+)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage depends on p53 and p21S phaseH1H2AH2BH4BH2AH4GAPDHH2BH1Time after irradiation0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr020406080100120% control0468101214Time after irradiation (hr)2HCT116（p53+/+,p21-/-)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage