高活性苎麻脱胶菌制霉菌素抗性菌株的选育-生物技术通报

1、高活性苎麻脱胶菌制霉菌素抗性菌株的诱变选育（生物技术通报2009.12）曾莹1，向新柱2（1.湖北工业大学生物工程学院 武汉 430068；2.武汉科技学院 武汉 430073）摘要：利用制霉菌素抗性来筛选高渗透性突变株，提高黑曲霉菌对苎麻纤维的脱胶能力，使微生物脱胶能用于工业生产实践之中。分别用紫外线、硫酸二乙酯、亚硝酸作为诱变剂对黑曲霉菌株进行诱变处理。以制霉菌素抗性为遗传标记，从突变菌株中定向筛选得到一株高活性苎麻脱胶菌黑曲霉。在以未经刮制的苎麻韧皮为主要碳源，0.7%(NH4)2SO4为氮源，添加0.05%KCl;0.05%MgSO4;0.1%K2HPO4; 0.1%酵母膏；Tween

2、80 0.1%的培养液中，接入黑曲霉，置30下，150r/min处理30hr左右，脱胶苎麻纤维的残胶率平均为14.43%。关键词：诱变育种，定向筛选，制霉菌素抗性，苎麻脱胶菌，黑曲霉.中图分类号：TS192.55 文献标识码：AMutation Breeding of Nystatin resistant microorganismwith high Ramie Degumming activity.Zeng Ying1, Xiang xin zhu2,(1.College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan ,43

3、0068）（2.Wuhan Institute of Science and Technology, Wuhan ,430073）Abstract:In order to improve the ramie degumming capability of Aspergillus niger strain, Nystatin resistance was employed for screening high permeable mutation strain so that microorganism degumming can be applied into industrial produ

4、ction. The Aspergillus niger strain was mutated by UV light, DES, and nitrite treatment. The strain Aspergillus nigerAspergillus niger unwipered ramine bast as the main carbon source, 0.7% (NH4)2SO4 as nitrogen source, in addition with 0.05%KCl; 0.05%MgSO4; 0.1%K2HPO4; 0.1% yeast extract；Tween80 0.1

5、%.This incubation lasted 30hr at 30 and 150r/min, the average residual gum content of ramie fiber was 14.43%.Key Words: mutation breeding；directive breeding；nystatin resistance；degumming strain of ramie；Aspergillus niger.苎麻脱胶是影响苎麻纤维纺织加工的关键，传统的化学法脱胶不仅对苎麻纤维有一定的损伤，会严重污染环境，而且破坏了苎麻纤维本身具有的多种对人体有益的保健功能，残留的

6、化学物质影响人体健康。1生物法脱胶则是利用微生物或微生物产生的酶将胶质分解。其作用条件温和，对纤维损伤小，还能提高苎麻纤维的光泽度，而且生物法脱胶耗水少，污染轻，有利于环境保护2-3 。多年来，国内外在微生物脱胶方面进行了一系列的研究，但因所筛选到的脱胶菌株脱胶关键酶活力不高或分泌的酶系不全，苎麻经微生物脱胶处理后仍然不能达到纺织工业生产上对苎麻纤维的要求，而未能完全替代化学脱胶广泛应用于工业生产中4-6 。为了提高菌株脱胶的能力，一个重要方法是进行诱变育种。而选用合适的诱变剂及特殊的筛选方法(即“筛子”)是提高诱变效果的关键所在。本研究试图对筛选得到的一株苎麻脱胶菌分别用紫外作者线、硫酸二乙

7、酯、亚硝酸作为诱变剂进行诱变处理，以Nystatinr为标记，定向筛选得到高活性苎麻脱胶菌。 1.材料与方法1.1材料原麻 未经刮制的有壳苎麻 由湖北省咸宁市天化麻业公司提供菌种：黑曲霉（Aspergillus niger）主要试剂：木聚糖、果胶，美国sigma公司；羧甲基纤维素钠，上海化学试剂公司。斜面培养基： 蔗糖20g，酵母膏10g，蛋白胨10g，琼脂20g，PH自然 选择平板培养基：上层为无机盐溶液（K2HPO4 0.7 g，NH4NO3 1.0 g，NaCl 0.005 g，ZnSO4 0.002 g，KH2PO4 0.7 g，MgSO4 0.7 g，MnSO4 0.001 g，Fe

8、SO4 0.002 g，H2O 1000ml），去氧胆酸钠 1.0 g，苎麻韧皮粉 10.0 g，琼脂 20.0 g，PH自然。下层为无机盐溶液1000ml，琼脂20.0 g，PH自然脱胶发酵培养基：苎麻条60 g，酵母膏4.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，（NH4）2SO4 7.0 g， Tween80 1.0 g，H2O 1000ml，pH自然。1.2方法菌种的活化 将保藏菌种接入斜面培养基中，置30 OC下培养3d最低抑菌浓度（MIC）的测定用稀释平板法测定nystatin对黑曲霉的最低抑菌浓度（MIC）。诱变处理以DES、HNO2、UV为诱

9、变剂，分别用不同剂量的诱变剂对出发菌株的孢子悬浮液进行处理。突变株的分离将经诱变处理的孢子悬浮液涂于含最低抑菌浓度nystatin的选择平板上，置30下恒温培养箱中培养72hr左右，观察并记录结果,生长良好的菌落即为抗性突变株。将突变株接入斜面培养基上，置适宜条件下培养。突变株的筛选1.2.5.1平板初筛 往含最低抑菌浓度nystatin的选择平板上注入Lugol I2液，染色5min；用生理盐水漂洗5 min后，测HC值。HC值透明圈直径/菌落直径1.2.5.2摇瓶初筛（脱胶发酵实验） 将孢子浓度为3.05.0×106个/ml的孢子悬浮液定量接入摇瓶筛选培养基中，置30下150r/

10、min,培养30hr左右，测定残胶率。.3复筛：苎麻生物脱胶实验 残胶率的测定根据国家标准GB5889-86测定脱胶麻纤维的残胶率。酶活力的测定.1酶液的制备 取置一定条件下的培养瓶，将脱胶培养液过滤，滤液即为酶液。.2纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶活力测定 用DNS法7.酶活力单位定义为：在50、PH4.6条件下，每分钟水解底物产生1g还原糖所需的酶量为一个酶活力单位，以U/ml表示。即：酶活单位NG/ 0.1×10g还原糖/min.其中 N酶液稀释倍数；G酶解液中还原糖的含量，g；0.1 加酶液量，ml 10酶解时间(min)2.结果与分析2.1最低抑菌浓度（MIC）的测定制备nys

11、tatin系列浓度梯度稀释液，分别加入选择平板培养基中，取孢子悬液点接于平板上，30 oC培养40 hr左右，观察平板上的菌株生长情况，确定nystatin对出发菌株的最低抑制浓度（以未长菌平板所含最低药物浓度为药物对出发菌株的最低抑制浓度）。由表1可知随着nystatin浓度增加，平板上菌株的生长量下降，当选择平板培养基中nystatin的浓度达到8.75 ug/ml时平板上无菌落形成。故nystatin对黑曲霉菌株的最低抑菌浓度为8.75 ug/ml。表1 nystatin对黑曲霉生长的影响Tab 1. Effect of nystatin on the growth of Aspergi

12、llus nigerNystatin(ug/ml)11.25108.757.56.255.03.750growth- - - - - - -+ + + + + + + + + +注：表中+；表示菌株生长，+的个数表示菌株生长量。-；表示未长菌。2.2突变株的分离筛选 从含nystatin最低抑菌浓度的平板上分离到63株nystatin抗性突变株，通过平板培养测定HC值和摇瓶发酵检测残胶率，其中16 株的脱胶效果较好。表2. 突变株初筛结果Tab 2. Initial screening result突变株HC值残胶率（%）突变株HC值残胶率（%）突变株HC值残胶率（%）3.0.2-32.791

13、7.413.0.2-261.6314.383.0.2-512.6815.883.0.2-42.2217.063.0.2-382.5714.723.0.2-562.9814.843.0.2-81.6815.413.0.2-392.1414.213.0.2-573.5615.223.0.2-132.4415.143.0.2-411.5615.053.0.2-602.1915.613.0.2-192.4114.733.0.2-422.2214.75出发株3.0.2-252.9413.703.0.2-482.9315.29An3.0.22.2816.97注：以上数据为三次实验的平均值。由表中数据可见H

14、C值与残胶率并不一定成正相关。这可能与菌株在平板上和在摇瓶中的培养环境有所不同有关8-10。其中与出发菌株比较，残胶率降低了13%以上的菌株有6株，其胶质去除率见表3。其中-25的脱胶效果最好，胶质去除率达65.21%比出发株提高了14.58%。表3.主要突变株的脱胶能力Table 3. Degumming activity of major mutants突变株胶质去除率（%）突变株胶质去除率（%）3.0.2-1962.603.0.2-3862.623.0.2-2565.213.0.2-4262.543.0.2-2663.483.0.2-3963.92出发株56.91苎麻微生物脱胶的原理是利

15、用脱胶菌发酵产生的脱胶酶作用于苎麻，将苎麻中的胶质酶解为可溶于水的小分子物质，获得分离的纤维束11-12。为此，对胶质去除率在63.%以上的3个菌株进行酶活力的测定，依据高木聚糖酶活、果胶酶活，低纤维素酶活、残胶率的原则进行筛选。结果见表4.表4. 突变株复筛结果Tab 4. Secondary screening result.突变株酶活力（ug/ml）残胶率（%）木聚糖酶果胶酶纤维素酶3.0.2-252238.844723.63116.1112.733.0.2-263966.55599.99112.511.993.0.2-391895.93410.0078.8914.18由以上表中数据综合

16、分析可见，-26菌株较好。将以上菌株连续转接6代进行脱胶发酵，分别测定残胶率,结果见表5。比较可见-26菌株的遗传稳定性较好。表5.菌株的稳定性Table 5.Stability of the strain传代次数（代）123456标准差（S）残 胶 率（%）3.0.2-25菌株12.6914.7313.6913.7414.1115.410.9370253.0.2-26菌株13.4814.4315.2414.0213.8015.60.8357613.0.2-39菌株13.7115.8913.0413.9516.4414.561.3190513.小结以Nystatinr为标记，从经过诱变育种处理

17、的突变株中定向筛选得到一株高活性苎麻脱胶菌黑曲霉-26。后，脱胶麻的残胶率平均为14.43%，比出发株下降了14.97%。虽然经菌株脱胶处理后脱胶麻的残胶率偏高，达不到纺织工业生产上对苎麻纤维残胶率的要求（残胶率2.0%），但是可以通过再进一步育种处理提高菌株的脱胶能力以及进一步优化脱胶工艺使脱胶麻纤维含胶率降低，为更好地应用现代生物科技制备高品质麻纤维材料，实现绿色加工创造良好条件。参考文献：1.杜兆芳，曹建飞，张强. 苎麻复配生物酶脱胶工艺的研究J.苏州大学学报（工科版），2008，28（2）：27-29Du Zhaofang,Cao Jianfei,Zhang Qiang. Proces

18、s of Compound Enzymes Degumming of RamieJ.Journal of Suzhou University(Engineering Science Edition)，2008，28（2）：27-292.肖丽,王贵学,陈国娟. 苎麻酶法脱胶的研究进展J.微生物学通报，2004，31（5）：101-105Xiao Li,Wang Guixue,Chen Guojuan.The Research Advancement of the Enzymatic Degumming of RamieJ.Microbiology, 2004，31（5）：101-1053.刘正初

19、，彭源德，冯湘沅，等. 苎麻生物脱胶新技术工业化生产应用研究J.纺织学报，2001，22（2）：27-29Liu Zhengchu,Peng Yuande,Feng Xiangyuan et al.A Study on Industrial Application of A New Technique for Ramie Degumming by Microorganism.J.Journal of Textile Research, 2001，22（2）：27-294.胡国全，张辉，邓宇，等. 苎麻的厌氧微生物脱胶条件试验J.中国沼气，2003，21（4）：10-12Hu Guoquan,Z

20、hang Hui,Deng Yu et al.Studies on Ramie Degumming by Anaerobic Microorganism.J.China Biogas, 2003，21（4）：10-125.钟安华，谭远友，王成国. 苎麻嗜碱细菌酶脱胶工艺研究J.印染助剂，2004，21（3）：24-26Zhong Anhua,Tan Yuanyou,Wang Chengguo.Study on the ramie degumming process with basophil bacterium enzymes. J.Textile Auxiliaries, 2004，21（3

21、）：24-266.黄俊丽，王贵学.脱胶关键酶基因的克隆及其在黑曲霉中的整合表达J. 微生物学通报，2005，32（3）：62-67Huang Junli,Wang Guixue.Gene Cloning of the Crucial Degumming Enzyme and Its Integration and Expression in Aspergillus nigerJ.Microbiology, 2005，32（3）：62-677.曾莹，钟晓凌，夏服宝 木聚糖酶活力测定条件研究J. 生物技术， 2003，13（5）：21-22Zeng Ying,Zhong Xiaoling,Xia

22、Fubao.Research for Measurement Condition of Xylanses Activity.J.Biotechnology， 2003，13（5）：21-228.韩铭海，黄俊，余晓斌.高产中性纤维素酶菌株的诱变选育和筛选方法J.无锡轻工大学学报， 2004，23（6）：9-12Han Minghai，Huang jun，Yu Xiaobin.Screening of Mutant Strains with High Neutral Cellulase Activity.J.Journal of Wuxi University of Light Industry， 2004，23（6）：9-129.林捷，郑华，石木标，等. 细菌木聚糖酶高产菌的选育及发酵工艺研究J.微生物学杂志，2004，24（1）：5-7Lin Jie，Zheng Hua，Shi Mubiao，et al.Study on Selective Breeding and Culture of Bacteria Producing Stable -xylanaseJJournal of Microbiology，2004，24（1）：5