α-共核蛋白基因与神经系统变性疾病

1、    -共核蛋白基因与神经系统变性疾病        Maroteaux等1首先从太平洋电鲟鱼（torpedo california）的带电器官中分离得到一种蛋白质， 基于它主要位于神经突触和细胞核膜上而被称为共核蛋白(synuclein）。至今,在不同的种系中已发现近200多种与共核蛋白基因同源的DNA和蛋白质，它们被分为三类：-共核蛋白，-共核蛋白和-共核蛋白。但引起人们极大兴趣的是-共核蛋白与神经系统变性疾病关系的发现。1993年Ueda 等2在人类阿尔茨海默病（Al

2、zheimer disease, AD）淀粉样斑块中的非A蛋白成分中分离到一种新的蛋白被命名为非A蛋白的成分(non-amyloid-component，NAC)，后来证实NAC的前体蛋白（non-amyloid-component precursor,NACP）就是-共核蛋白。最近发现-共核蛋白基因的突变与家族性帕金森病（Parkinson disease, PD）相关，并发现它在多种神经系统变性疾病的Lewy体和胶质细胞胞浆包涵体中均有高表达，提示它可能为此类疾病发生的分子桥梁而成为研究的热点。一、 -共核蛋白基因突变与家族性PD1996年Polymeropoulos 等3对1个源于意大利

3、Contursi家族进行家系连锁分析，将引起该家族性PD的相关基因定位在染色体4q2123；后来对位于该区域的-共核蛋白基因的外显子编码序列进行分析后发现，除1例PD患者外，该家族的其余患者均为-共核蛋白基因第四号外显子错义突变（G209A, Ala53Thr）的杂合体。该种突变也在3个源于希腊的家族性PD中被发现，但正常人未发现带有该突变，提示该突变很可能是导致家族性PD的原因4；1998年Kruger等5在研究192例散发性PD患者和7个家族性PD患者时，虽然他们未发现Ala53Thr突变，但在德国PD家系中发现4 例患者的-共核蛋白基因的第三号外显子中存在另1个不同突变（G80C, Al

4、a30Pro），这一发现更加证实了-共核蛋白基因与家族性PD的关系。但随后对散发或其他家族性PD -共核蛋白基因突变的研究均有一些阴性报道。Vaughan 等6利用脑组织提取DNA，对30例欧洲和美洲的高加索PD患者-共核蛋白基因所有7个外显子进行扩增和直接测序，在所有的开放阅读框架中未发现任何突变。陈彪等7, 8从24例确诊为PD患者的脑组织中提取RNA，通过反转录PCR获得-共核蛋白基因，并对该基因的所有编码序列进行测序，也未发现任何突变存在；此后他们又对100例早发性PD患者的DNA进行检测，也未发现-共核蛋白基因G209A位点的错义突变。 Lin等9报道中国台湾地区的帕金森病患者中亦未

5、发现-共核蛋白基因的G209A和G88C两类突变。Farrer 等10对家族性PD、多系统萎缩（MSA）及Lewy体痴呆患者进行了-共核蛋白基因第四外显子测序分析，也未发现任何突变存在。Ozawa等11分析了11 例通过病理证实的尸检MSA患者的大脑白质和灰质，在-共核蛋白基因的编码区和非编码区并未发现任何突变存在。Vaughan等12就230例欧洲人种家族性PD进行G209A位点错义突变的检测，亦无阳性发现。虽然不能排除在这一基因的其他操纵子或内含子区域存在某些突变的可能，但上述研究结果提示，家族性PD中，发生的-共核蛋白基因突变是非常罕见的；尽管如此，研究和了解-共核蛋白引起多巴胺神经元变

6、性，对认识PD的发生机制有重大意义。二、-共核蛋白与Lewy小体的关系Spillantini 等13利用免疫组化方法发现PD患者脑中特征的Lewy体以及Lewy神经轴束中存在大量的-共核蛋白，但这些患者并不存在-共核蛋白基因外显子的突变。Wakabayashi 等14检查PD患者脑干中的变性神经元及Lewy体，发现有较多的NACP存在，他们推测-共核蛋白代谢的改变可能与PD的发生机制，尤其是Lewy体的形成相关，-共核蛋白的过多表达，不但在PD患者中发现，它也存在于Lewy体型痴呆和弥散性Lewy体病的Lewy体中。但也有人认为-共核蛋白基因的低表达与帕金森病的发生相关15。最近，Takeda

7、等16 利用免疫双标记法和激光共聚焦显微镜研究了Lewy体中的-共核蛋白活性，在有免疫标记病理斑的Lewy体、变性的神经突触和营养不良性突触中均发现有-共核蛋白存在。免疫双标记研究提示所有3种神经病理结构都包含泛素（ubiquitin），丝佛什(synaptophysin)和神经丝的免疫反应。有人认为-共核蛋白的免疫组化染色分析可能取代泛素检测而成为新的、更敏感的“分子标记”；510 nm纤丝的形态学和它们的染色特征提示延伸的-共核蛋白分子与纤丝轴相平行，这一纤丝具有极性结构。许多类似的研究结果显示，-共核蛋白是Lewy体的主要成分之一，但不清楚它为什么会聚集在Lewy体内。三、-共核蛋白与淀

8、粉样斑块的关系1993年Ueda 等2在人类AD患者脑的淀粉样斑块的非A蛋白的成分中分离到NAC，后来证实NAC的前体蛋白就是-共核蛋白，但在AD患者中并未发现-共核蛋白基因突变的存在。体外实验采用不同长短片段的-共核蛋白与A作用，发现-共核蛋白与A的结合可促进A的聚集，同年Jenson等17发现，谷氨酰胺转移酶（transglutaminase）可促进-淀粉样肽多聚体的形成，而-共核蛋白中有一高度保守的氨基酸序列与谷氨酰胺转移酶反应有关。1996年Iwai 等18发现，早期AD患者脑内NACP的免疫反应性是中至晚期患者的2倍，认为-共核蛋白在AD早期患者中的增高对AD的神经变性、突触损害起到

9、一定作用。1997年Jenson等17发现-共核蛋白与-共核蛋白在体外实验中均能促进A聚集，认为-共核蛋白中的多个A 结合位点与淀粉斑块的形成有关。1998年 Paik 等19进一步发现，-共核蛋白只在切去N末端的A存在时才自我聚集形成寡聚体，后者在AD的斑块形成中起到核团中心的作用。Samii等20通过PET研究提示：那些来自希腊家族的、生活在美洲的、具有-共核蛋白基因突变的、常染色体显性遗传的帕金森病患者，他们大脑中壳核和尾核的18F-6-氟-多巴的摄入明显减少，提示黑质纹状体系统的多巴胺能神经元缺乏与-共核蛋白基因突变相关。Conway 等21发现那些具有-共核蛋白基因突变的早发性帕金森

10、病的发生机制可能与-共核蛋白自身的低聚合作用而非纤维化作用相关。四、-共核蛋白与胶质细胞胞浆中包涵体的关系MAS包括橄榄小脑萎缩(OPCA)、纹状体黑质变性(SND)和Shy-Drager综合征(SDS)。这些疾病多表现为不对称的帕金森综合征、小脑损害、锥体束损害以及植物神经损害的症状和体征；病理改变包括纹状体、黑质、橄榄核、桥脑和小脑等出现特征性的胶质细胞胞浆内嗜银包涵体(glial cytoplasmic inclusions,GCIs)以及神经元丧失、胶质细胞增生、色素沉着等，但不存在Lewy体和神经纤维缠结变性。由于这些均具有特征性的 GCIs而归为一类疾病，GCI也就成为确诊 MSA

11、 的病理特征指标。最新研究显示，这些GCIs 存在有大量的-共核蛋白，提示这些小体的形成或神经变性可能与-共核蛋白有关。Spillantini 等13采用免疫组织化学的方法，研究MSA 患者脑组织中-共核蛋白的分布，结果发现在MSA患者的 GCIs 中有强烈的-共核蛋白免疫反应，以黑质、桥脑、下橄榄核等部位最多，显示-共核蛋白是MSA脑中 GCIs主要成份之一。 Tu 等22为了确定是否-共核蛋白在GCls的形成中起作用，检测了MSA患者胶质细胞胞质GCls中的-共核蛋白，通过免疫染色电镜检查发现-共核蛋白多出现在大脑白质少突胶质细胞GCls的纤丝中，他们推测-共核蛋白在细胞质中的溶解与渗透可

12、能促进胶质细胞变性、功能减退以致死亡。五、 -共核蛋白基因的功能、表达和调节目前已经清楚，-共核蛋白基因位于4q21.3q22, 由6 个外显子和若干个内含子组成；翻译起始密码ATG位于第二号外显子，在第一号外显子有2种不同的拼接位点（splicing sites），因此，转录产生2种含有不同5端非翻译序列的-共核蛋白cDNA，翻译产物为1个由140个氨基酸组成的相对分子质量为19 000 蛋白。Maroteaux 等23发现，-共核蛋白仅仅在神经组织中表达，而不在电亲和性器官，如肌肉、肝、脾、心或肾中表达；-共核蛋白在新皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑含量较高，脑干则含量较低；由于-共核蛋白主

13、要分布在神经细胞的突触前膜，推测它与突触前膜功能有关。Hsu 等24用RNA酶保护分析法、Western blot和免疫组化等方法分析了胚胎、幼稚和成年小鼠脑组织的-共核蛋白和其他突触蛋白的水平14，发现胚胎15 d以后均有显著增加，其中-共核蛋白增加的时间明显偏早，提示这种蛋白对突触发生及中枢神经系统的发展是重要的。George等25研究发现，在斑雀等鸟学唱歌的过程中，-共核蛋白的同源蛋白赛尼芬 (synelfin)在脑中的表达明显增加，提示-共核蛋白可能与神经元的可塑性相关。-共核蛋白基因的功能还不完全清楚，它的表达调控研究刚刚起步。Davidson 等26假定-共核蛋白与磷脂双层的连接能

14、够稳定这种蛋白-螺旋的二级结构，他们通过实验发现那些包含了酸性磷脂的较小的林玫娜(unilamellar)磷脂囊泡，多与-共核蛋白相连，而且这种蛋白优先与直径2025 nm的囊泡连接，而不与直径大于125 nm的囊泡相连，这一蛋白与脂质连接后伴随着-螺旋从3增加到80。Hashimoto 等27的实验显示在造血细胞系K562细胞中，当佛波酯诱导巨核细胞分化时，上调了-共核蛋白基因的表达，同时能下调-共核蛋白基因的表达；但在血小板中仅有-共核蛋白的丰富表达，提示-共核蛋白成员的协调表达在巨噬细胞分化中具有关键作用。Kholodilov 等28发现下调-共核蛋白基因的表达与诱导神经元凋亡并无相关。

15、 -共核蛋白与第二信使通路的相关性研究有特殊意义，它在鼠脑中呈现为双重性，小分子可溶，大分子显示与突触膜相关。Maroteaux 等23将共核蛋白基因cDNA片段与来自大鼠cDNA文库的一些克隆片段杂交，发现这种cDNA克隆编码了一些与电鲟鱼（Torpedo）蛋白有类似生物活性的蛋白；通过原位杂交显示，在被分离的鼠脑区域均有共核蛋白mRNA的表达，其中海马是最富集的部位；这一结果提示，-共核蛋白类分子涉及到与磷酸肌醇相关的第二信使通路。Jenco等29借助蛋白微序列分析和Western Blot分析发现，重组表达的-和-共核蛋白在体外能抑制磷脂酶D2（PLD2）的活性，这种作用不能被PLD1的

16、蛋白或脂质活化剂所翻转；由于PLD2是信息转导中的重要中介物，而共核蛋白与PD和AD等疾病发生均相关，他们从而推测，通过共核蛋白调控PLD2的活性，也许在神经系统变性疾病的发生发展中起着较重要作用。 (本文编辑：陈秀华)作者单位：柏华（100053 北京，首都医科大学宣武医院神经内科）陈嵘（Parkinsons Institute, 1170 Morse Avenuce,Sunnyvale,CA94089 USA）陈彪（Parkinsons Institute, 1170 Morse Avenuce,Sunnyvale,CA94089 USA）参考文献1，Maroteaux L, Campan

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