SOD对脑缺血-再灌注损伤大鼠谷氨酸转运体功能的影响＊

1、    SOD对脑缺血-再灌注损伤大鼠谷 氨酸转运体功能的影响        摘要目的：探讨超氧化物歧化酶(SOD)对脑缺血再灌注 损 伤(I-R)大鼠皮层、海马、纹状体谷氨酸转运体功能的影响。方法：采用大 鼠3个血管夹闭、松夹复制脑I-R损伤模型。利用脑组织突触膜颗粒对3H-L-谷氨酸摄 入量 的测定及分光光度法观察SOD对皮层海马纹状体谷氨酸转运体功能、丙二醛(MDA)含量及SO D 活性的影响。结果：I-R组谷氨酸转运体的功能及SOD活性明显低于对照组( P0

2、.05，0.01)，MDA含量明显高于对照组(P0.05，0.01)。SOD+I-R 组大鼠谷氨酸转运体的功能及SOD活性明显高于I-R组(P0.05， 0.01)；MDA含量明 显低于I-R组(P0.05， 0.01)。结论：SOD可改善I-R后脑组织谷 氨酸转运体的功能，其机制可能与清除自由基有关。主题词再灌注损伤；过氧化物脂质类；超氧化物歧化酶；大鼠 Influence of SOD on the function of glutamate transporterin ra ts with injury of cerebral ischemia-reperfusionREN Xiao-Y

3、an, GE Bao-Lin, QU Zhong-Sen, ZHANG Yu-Min Department of Pathophysiology, Medical College of Qingdao University, Qin gdao(266021)Abstract AIM：To investigate the effect of superoxide dismutas e (SOD) on the function of glutamate transporter in rats with injury of cerebral i schemia-reperfusion.METHOD

4、S：A model of ischemia-reperfusion injur y(I-R) was performed by clipping three arteries and then by releasing them to rep erfuse blood into ischemic brain in rats. Glutamate transporter functions were s tudied by means of assay of 3H-L-glutamate uptake in synaptosomes, and malo ndialdehyde (MDA) con

5、tents and SOD activities in cerebral contex, hippocampus ,s triatum by spectrophotometry.RESULTS：Glutamate transporter functi on and SOD activity in I-R group significantly decreased (P0.05，P 0.01) ;content of MDA significantly increased(P0.05， P0.01) compared with contr ol group. Glutamate transpor

6、ter function and SOD activity in SOD group significa ntly increased (P0.05， P0.01);MDA content significantly decrease d(P0.05，P0.01) compared with I-R group.CONCLUSION：SOD can improv e glutamate transporter function of I-R rats. The mechanism might be related to eliminate free radicals.MeSHReperfusi

7、on injury; Lipid peroxides; Superoxide dismutas e; Rats谷氨酸存在于兴奋性突触前神经末梢，遍布整个脑组织。其在突触间 隙中过多的积聚可产生神经毒性作用。正常情况下，神经元及神经胶质细胞膜上的谷氨酸转 运体在其毒性发生之前能很快清除突触释放的谷氨酸1。在体外培养的星状胶质 细胞实验证实，氧自由基可抑制谷氨酸转运体的摄取功能2。在缺血及再灌注时 形成大量的氧自由基参与神经毒性损伤的形成。本工作用大鼠脑缺血-再灌注损伤模型，观 察超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)对谷氨酸转运体功能的影响，并同时检测了 脑组织丙二醛

8、(malondialdehyde,MDA)含量及SOD活性的变化，以期探讨其机制。材料和方法一、实验材料：3 H-L-谷氨酸(美国杜邦公司，152.07×1010 Bq/mmol)；SOD(河 北保定市生化营养源开发中心，4 000 U/mg)；MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程 研究所)。高速冰冻离心机(日本Tomy 公 司出品，RS-20型)；液体闪烁计数仪(瑞典LKB公司出品，1209型)；分光光度计(上海分析 仪器厂出品，751型)。二、实验方法：1.动物模型复制：健康Wistar大鼠24只(250350 g)，雌雄兼用，随机分为3组，每组8只。Ischemia-re

9、perfu sion(I-R)组：20%的乌拉坦0.5 mL/100 g ip麻醉，行颈部手术，分离两侧颈总动脉，于甲 状软骨上缘右侧分离肌肉至枕骨腹面，先在枕骨嵴旁钻1小 孔，扩大为3 mm×2 mm大小的骨窗，暴露基底动脉，用特制无损伤的动脉夹夹闭上述3个动脉，脑电变为一平 线，观察120 min，然后将3个动脉夹全部放开，继续观察30 min。SOD+I-R组于夹闭血管前10 min静脉推 注 SOD(680 U/100 g大鼠)，手术过程同I-R组。对照组实验过程基本同I-R组，但血管不夹闭， 。实验完毕后断头取脑，按自然分界分离皮层、海马、纹状体，液氮冷冻，-70冰箱保存

10、。2.谷氨酸转运体膜颗粒制备：脑组织用10倍(W：V)的匀浆液(0.3 mol/L)甘露醇，1 mmol/L EDTA钠，pH7.4)匀浆后，以 6 000r/min离心10 min，取上清液，4，15 000 r/min离心20 min，混旋，依次加低张缓 冲液(1 mol/L Tris，0.5 mol/L EDTA钠，pH7.4)，悬浮缓冲液(100 mmol/L磷酸钠，5 mm oL/L Tris-SO4, 100 mmol/L MgSO4，0.5 mol/L EDTA钠，1%甘油，pH 7.4)，装载 缓冲液(0.1 mol/L 磷酸钾，1 mmoL/L MgSO4，pH6.8)，分别

11、在4， 15 000 r/min离 心20 min，均取沉淀，最 后加装载缓冲液备用。3.谷氨酸转运体功能测定：取突触膜颗粒20L加入膜外液(0.15/L NaCl 180L，0.25L 3 H-L-谷氨酸)中， 置30水浴中反应10 min，用2 mL冰冷0.15/L NaCl终止反应，迅速倒在孔径为0.45 m的滤 膜上定时(40 s)定量(24 mL)地用冰冷NaCl冲洗抽滤，滤膜烘干置于液闪瓶中，隔夜在液体 闪烁读数仪上测定。样本均做双管。膜颗粒的蛋白测定采用Lowry法。谷氨酸转运体的功能 表达为膜颗粒对谷氨酸的摄入量(nmol*min-1* mg-1 Pr)。4.MDA含量、SOD

12、活性测定：采用分光光度法测定MDA含量和SOD活性。MDA采用10%的匀浆 ，其含量单位为nmol/mg湿重；SOD采用1%的匀浆，活力单位为U/mL。5.统计处理：实验结果以±s表示，组间比较采用方差分析。结果一、SOD对谷氨酸转运体功能的影响：I-R组皮层、海马、纹状体谷氨酸转运体的功能低于对照组(P0.01)；SOD+I-R组皮 层、海马、纹状体谷氨酸转运体功及SOD活性显著高于I-R组(P0.01，P0.0 5)，见表1。?表1SOD对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织谷氨酸转运体功能的影响Tab 1 The influence of SOD on glutamate transp

13、orterfunction in ra ts with injury of cerebral ischemia-reperfusion (pmolmin-1mg- 1 Pr，±s,n=8)GroupContexHippocampusStriatumControl1.83±0.411.30±0.174.45±1.04I-R1.36±0.32*0.95±0.12*2.65±0 .61*SOD+I-R1.72±0.191.46±0.463.29±*P0.05，*P0.01， vs control;P0

14、.05， P0.01，vs I-R group二、SOD对脑组织MDA含量的影响：I-R组皮层、海马、纹状体MDA的含量显著高于对照组(P0.05， 0.01)；SOD+I-R组 皮层、海马、纹状体MDA含量显著低于I-R组(P0.05，P0.01)，见表2。表2SOD对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织MDA含量的影响Tab 2 The influence of SOD on MDA content in ratswith injury of c erebral ischemia-reperfusion(nmol/mg，±s,n=8)GroupContexHippocampusStria

15、tumContro20.13±0.7515.93±1.6016.03±2.36I-R22.27±0.18*19.10±0.94*20.03± 1.86SOD+I-R20.59±1.7716.31±2.0016.96±1.96 *P0.05，*P0.01， vs control;P0 .05，P0.01，vs I-R group三、SOD对脑组织SOD的影响：I-R组皮层、海马、纹状体的SOD活性显著低于对照组(P0.05，P0.01)；SO D+I-R组的SOD活性明显高于I-R组(P0.01，P0.05

16、)，见表3。表3SOD对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织SOD活性的影响Tab 3 The influence of SOD on SOD activity inrats with injury of cerebral ischemia-reperfusion(U/mg，±s,n=8)GroupContexHippocampusStriatumContro117.50±4.51124.64±15.42108.80±5.68I-R110.55±5.08*104.20±6.87*99.31 ±6.70*SOD+I-R122.65&#

17、177;6.36123.70±17.62109.99± 5.66*P0.05，*P0.01， vs control;P0.05， P0.01，vs I-R group四、相关性分析：I-R组皮层、海马、纹状体谷氨酸转运体的功能降低与MDA含量升高呈负相关(r=0.900 ， 0.923， 0.748，P0.01， P0.05)，与SOD活性降低呈正相关(r=0 .847， 0.894， 0.973， P0.01)。讨论谷氨酸是一种兴奋性神经递质，但其异常积聚可严重损伤神经细胞。生理情况下，谷氨酸从 神 经元突触前膜释入突触间隙，继之作用于突触后膜的受体产生神经兴奋作用，经神

18、经细胞突 触前膜和神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运体重新摄取、贮存，从而维持其脑内水平的相对稳 定 。而脑缺血-再灌注时由于谷氨酸的再摄取功能降低可出现谷氨酸在神经元突触间隙中异常 积聚，由此引起Na和水进入神经细胞或出现钙超载而诱发脑神经细胞各种损伤性变化。 据报道，幼鼠纹状体在1 h的体内缺血缺氧后其谷氨酸的再摄取大约减少一半3，4 。本实验发现，缺血再灌流后皮层、海马、纹状体谷氨酸转运体的功能均降低，并伴 随着MDA含量升高和SOD活性降低。由此提示，缺血及其再灌后突触间隙中谷氨酸的增多可能 与谷氨酸转运体的功能降低有关。在体外培养的大鼠皮层神经胶质细胞实验中发现，自由基 的形成可显著降低谷

19、氨酸转运体清除细胞外谷氨酸的能力。当在培养的细胞中加入氧自由基 时，谷氨酸转运体的再摄取功能进行性地受到抑制，加入自由基清除剂时，这种抑制作用解 除2。本实验发现：皮层、海马、纹状体谷氨酸转运体的功能均降低与MDA含量 的升高呈负相关，与SOD活性的降低呈正相关。说明其与自由基生成有关。SOD是一种带阴电荷的蛋白质，它通过歧化方式清除超氧阴离子自由基在缺血及其 再灌注时导致血脑屏障开放，可使SOD进入到内皮细胞的胞浆和脑组织细胞外间隙，发挥其 清除的作用5。本实验证实，在缺血及其再灌的组 织中氧自由基极为 丰富，不仅导致了非特异性的损伤，而且可使谷氨酸转运体的功能降低，兴奋性氨基酸释放 增加，

20、导致神经毒性作用的发生6。有报道脂质过氧化的抑制剂Vit E可预 防沙土 鼠缺血后CAI区椎体神经元的死亡7。本实验发现，外源性地给予SOD，可使皮层 、海马、纹状体谷氨酸转运体的功能显著提高，同时伴随着MDA含量的降低及脑组织SOD活性 提高。这可能与SOD具有较强的清除自由基、促使谷氨酸转运体的功能恢复作用，进而起到 保护神经细胞的作用有关。*国家自然科学基金资助(No.39400051)作者单位：任晓燕葛 宝林曲忠森张玉敏青岛大学医学院病理生理学教研室(青岛266021)参考文献1Schousboe A. Transport and metabolism of glutamate and GABA inneurons and glial cells. Int Rev Neurobiol, 1981,22:1.2Volterra A, Trotti D, Tromba C, et al. Glutamate uptake inhibition by o xygen free radicals in rat cortical ast