林千顺-研究生学位论文开题报告(终)

1、研究生学位论文开题报告研 究 生： 林千顺 学 号： 2013301110082 学 院： 植物科学技术学院 专 业： 作物遗传育种 学位级别： 硕士 学位类型： 学术型 研究方向： 水稻杂种优势利用 课题名称：分子标记辅助选择改良水稻恢复系R666的褐飞虱抗性 导 师： 牟同敏教授 指导小组： 曾汉来教授 沈金雄教授 肖本泽副教授 联系电-MAIL407167229入学年月2013年9月课题来源863计划课题性质纵向1、 摘要褐飞虱是水稻的重要害虫之一，对水稻生产造成严重危害。恢复系R666是高度抗倒伏的优良恢复系，为提高其对褐飞虱的抗性，便于培育更好的杂交水稻，本

2、研究利用分子标记辅助选择技术，将抗褐飞虱基因Bph14和Bph15导入到R666的背景中，通过抗性鉴定，组合测配等，选育出优质、高产的两系杂交水稻新组合。关键词：水稻；褐飞虱；抗褐飞虱基因；分子标记辅助选择二、立论依据（研究问题的由来，与选题有关的国内外研究综述，选题的目的与意义，拟解决的关键问题）1 选题的目的与意义褐飞虱是水稻的主要虫害之一，每年对我国南方稻区的水稻生产造成严重的危害。两系法杂交稻是我国南方籼稻产区的主要栽培类型之一。R666是安徽华韵生物科技有限公司选育的抗倒伏两系杂交水稻恢复系，所配组合Y58S/R666表现抗倒伏、优质、高产，但是不抗褐飞虱。本研究的目标是，运用分子标

3、记辅助选择技术，通过杂交、回交和表型选择，将抗褐飞虱基因Bph14和Bph15导入到R666的背景中，期望培育出基本保持R666原有特性、同时褐飞虱抗性明显提高的新恢复系，再通过组合测配，培育抗褐飞虱的两系杂交水稻新组合。其意义在于提高水稻的褐飞虱抗性，减少农药使用量，保护环境。2 国内外研究进展水稻是人类的重要粮食作物之一，同时也是我国的第一大粮食作物,约占粮食总产量的40%。在中国，从事稻作生产的农户接近农户总数的50%，全国有60%以上的人口以稻米为主食。除食用外，稻米还有多种用途。水稻生产不仅担负确保我国粮食安全的重任，还肩负实现种粮增效、稻农增收和全面推进新农村建设的重大使命。预计到

4、2030年，我国人口将达到16亿，我国农作物的单产需在现有的基础上提高60 %以上才能满足粮食的安全供给。虫害历来是影响水稻生产的一个重要因素，每年因为虫害而造成的含量损失高达15%左右，对我国的粮食生产产生重大影响。目前，对水稻害虫的防治措施主要以施用化学农药为主，但化学农药的使用，不仅增加了生产成本，降低生产收益，更造成了环境污染，农药残留等，对生态平衡严重破坏。因此，水稻虫害生物防治的方法日益得到重视，其中，培育抗虫品种是控制水稻虫害，降低生产损害的最经济有效的手段。水稻作为遭受虫害最多的粮食作物，在各个生育期均可受到害虫侵害。同时，水稻害虫种类繁多，有钻蛀茎杆的二化螟、三化螟，刺吸、锉

5、吸茎叶的褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱，食害叶片的稻纵卷叶螟等（张启发 2010）。而在虫害中，褐飞虱的危害尤为严重。就近30年褐飞虱发生情况而言，其发生面积及范围逐渐扩大，暴发频率增加，危害程度增加，造成严重损失。所以选育优质抗褐飞虱水稻品种十分重要。2.1褐飞虱的生物特性褐飞虱属同翅目、飞虱科，有远距离迁飞习性，为单食性害虫，只能在栽培稻和普通野生稻上取食与繁殖后代。褐飞虱的生命周期分为卵、若虫、成虫三个时期(祝莉莉等 2004)。褐飞虱的卵主要产在叶脉和叶片组织内，排列成一条，称为“卵条”。卵粒长1.0mm，宽0.22mm，初产时乳白色，渐变褐色，并出现红色眼点，同时初产及前期香蕉形，中后期弯

6、曲程度更加明显。若虫阶段分为5个时期：1-5龄，体长卵圆形，体色分深浅两种，深色型腹部背面斑纹暗褐色，浅色型体淡黄色，背面斑纹不明显，其中2-3龄若虫危害最大。成虫分为短翅型和长翅型，短翅型翅长短于腹部，繁育能力强，寿命长；长翅型翅长长于腹部，有较强的迁飞能力，能借助风力向周围扩散，对更多的稻区产生危害（程遐年等 2003）。褐飞虱生育的最适温度是2228，相对湿度80%以上。盛夏不热、晚秋不凉，凉夏暖秋、多雨湿润是褐飞虱种群增殖和危害的有利条件。夏季日最高温度33.5，或日平均温度30对褐飞虱有抑制作用，高温持续时间越长抑制作用越强。但在稻田中因水稻群体生长量大，植株下部的株间温度比大气温度

7、低3左右，相应地，稻田生存的褐飞虱种群在大气温度更高的条件下才受抑制。而秋季日平均温度低于17.5，严重影响褐飞虱的生存和为害（杨荣明 2014）。2.2褐飞虱的生物型由于昆虫与寄主植物的协同进化，害虫种群分化为不同的生物型。褐飞虱的生物型是指具有不同致害性的褐飞虱群体，当它们为害具有不同抗虫基因的水稻品种时，表现出不同的致害反应。根据褐飞虱种群对具有不同抗性基因的标准鉴定品种的致害性反应, 已有、及Mindano6等种生物型被国际水稻研究所正式命名, 以后陆续又在菲律宾的棉兰老岛、孟加拉、印度、尼泊尔、澳大利亚以及越南的九龙江等地发现新的褐飞虱致害种群。除以上这些危害水稻的生物型外, 198

8、4年在菲律宾和印度尼西亚还发现一种能危害李氏禾而不能危害水稻的褐飞虱种群,称之为李氏禾生物型（周亦红等 2003）。在东亚地区主要以、四种褐飞虱生物型为主。生物型不能危害具有任何抗虫基因的水稻品种；生物型可以危害具Bph1抗虫基因的品种，但不能危害具Bph2抗虫基因的品种；生物型可以危害具bph2抗虫基因的水稻品种；生物型可以同时危害具Bph1抗虫基因和bph2抗虫基冈的水稻品种（张启发 2010）。研究发现，不同稻区由于水稻品种的不同，其褐飞虱的生物型也差异较大。就我国而言，上个世纪80年代，褐飞虱群体主要以生物型为主，但进入90年代后逐渐转化为生物型，各地褐飞虱群体为生物型、的混合型（巫国

9、瑞等 1983）。21世纪以来，在褐飞虱致害类型的鉴定中发现，其生物型由、的混合型逐渐转化为生物型（吕丽萍等 2009）。关于褐飞虱生物型问题长期存在争论，主要围绕其生物型是否存在稳定的遗传性(姜人春 1999；周亦红等 2003)。肖英方等（1997）将在抗性品种Mudgo上长期饲养的生物型接回感虫品种上，连续培养8代以后，该群体转变成了生物型。王桂荣等（1999）将在ASD7上连续饲养30代的褐飞虱种群(生物型)饲养于TN1 上，饲养7代以后，该种群就不再能适应ASD7，表现出不能致害的特性。研究结果表明，褐飞虱生物型的致害性经品种“诱导”后可发生明显变异，而且褐飞虱在抗性水稻品种上的适应

10、性的增加是一个渐进的过程，世代间表现出可遗传的积累（吕亮等 2011）。褐飞虱生物型的形成是一个非常复杂的过程，不仅受其生物学特性的影响，还受到抗性水稻品种的胁迫，以及环境因素的影响，随着研究的进一步广泛和深入，褐飞虱致害性的分子遗传学机制, 品种抗性及品种-害虫互作机制等亟待深入研究。2.3褐飞虱对水稻的危害褐飞虱作为水稻的主要害虫，对水稻生产产生严重危害，其危害行为主要有以下三种：一是产卵为害。褐飞虱在稻株叶鞘等茎叶组织中产卵，形成大量伤口，使水分由伤口散失，同时破坏输导组织，同化作用减弱，导致稻株叶片发黄，易倒瘫。二是刺吸取食危害。褐飞虱成虫、若虫群集于稻丛基部，刺吸茎叶组织汁液，消耗稻

11、株养分，使谷粒不饱满，千粒重减轻，瘪谷串增加，刺吸取食时分泌的凝固性唾液形成“口针鞘”，阻碍稻株体内水分和养分输导。虫量多、受害重时引起稻株下部变黑、腐烂发臭、瘫痪倒状，称为“冒穿”、“透天”，导致严重减产或失收。三是传播水稻病害。褐飞虱在刺吸水稻时，会传播草状丛矮病和齿叶矮缩病（吴和生等 1994），导致水稻植株矮小，严重影响水稻生产，降低水稻产量。褐飞虱在刺吸或产卵时，在水稻表皮组织产生伤口，此时水稻纹枯病、小球菌核病病菌通过伤口感染致病。同时，褐飞虱排泄的“蜜露”富含糖类、氨基酸等，为煤烟球菌提供滋生环境。1991 年我国褐飞虱为害发生面积达到2320万hm2,损失稻166万t;2005

12、年更是大暴发, 为近十年之最, 仅长江中下游稻区就发生面积777.8万hm2 ,损失稻谷近15亿kg（傅强和张志涛 2005）。就褐飞虱为害对产量结构的影响，有学者的研究发现，褐飞虱在抽穗期、乳熟期、灌浆期对水稻为害会使总产量明显下降, 但以抽穗期的作用最明显。说明在同等虫口密度下, 受害期越早, 损失越重。而对于实粒数的下降，抽穗期和乳熟期两个生育期褐飞虱连续为害的影响较强。对于千粒重下降，主要受灌浆期为害的影响。但水稻各生育期之间存在明显的互作效应。抽穗期和乳熟期对千粒重的影响除直接效应外, 还通过对灌浆能力的影响降低千粒重。同时也说明抽穗和乳熟期降低结实率并不能提高千粒重, 说明水稻生育

13、后期的补偿效应不大（黄方能和程遐年1990；郝树广等 1997）。2.4水稻抗褐飞虱基因的研究进展为降低褐飞虱为害对水稻产量的影响，在水稻生产中，通常会采用化学药剂的喷洒，但此手段严重污染环境，不利于可持续发展，同时使生产成本增加。因此，培育抗褐飞虱水稻品种才是从根本上解决褐飞虱为害难题。作物的抗虫性是一种可遗传特性，可以由单基因调控，也可以由多基因调控。就水稻抗褐飞虱基因而言，20世纪70年代初，关于水稻抗褐飞虱基因的研究已出现，在通过多种遗传学方法的不断测定中，目前，经国际注册确认和报道的水稻抗褐飞虱基因共30个，显性基因有17个，隐性基因13个，其中已定位的主效抗性基因达到26个。这些已

14、定位的基因分别分布在2、3、4、6、8、12号染色体，其中2号染色体上有1个，3号染色体上有4个，4号染色体上有9个，6号染色体上有3个，8号染色体上有1个，12号染色体上有8个。Athwal等（1971）在CO22, IR747B2-6, MTU15, Mudgo等供体材料中，鉴定了首个抗褐飞虱显性基因Bph1，同时发现品种ASD7的褐飞虱抗性受单一隐性基因控制，并命名为bph2，且Bph1和bph2紧密连锁。Sharma等（2002）精确地将Bph1定位到第12 染色体上两标记em5814 和R2708 之间的5.8 cM 内，孙立宏等（2006）利用简单序列重复标记将bph2定位至第12

15、 染色体上RM7102 和RM463 之间，其遗传距离分别为7.6 cM和7.2 cM。Lakshminarayana 等（1977）在来自斯里兰卡的栽培品种Rathu Heenati和Babawee中分别鉴定出显性基因Bph3 和隐性基因bph4；Jairin（2010）等通过研究，将Bph3和bph4定位在水稻第6染色体短臂上的同一区间内，同时确定Bph3和bph4等位或紧密连锁。Klush等（1985）在ARC10550中发现新的隐性基因，命名为bph5。Kabis等（1988）在Swaranalatha品种中发现新的显性基因，命名为Bph6，在T12品种中发现新的隐性基因bph7。基因

16、bph5，Bph6，bph7均只对生物型表达抗性，其中Qiu等（2010）利用STS标记将Bph6精细定位在第4染色体上Y19和Y9之间大约25kb的区间内。Nemoto 等（1989）研究发现Chinsaba品种对褐飞虱的抗性受新隐性基因bph8的控制，而斯里兰卡农家品种Kaharamana的抗性则由另一个显性抗性基因Bph9 控制。其中，Bph9被定位于第12号染色体上RM463和RM5341之间，分别相距6.8cM和9.7cM（苏昌潮等 2006）。Ishii等（1994）从带有澳洲野生稻背景的基因渗入系IR65482-4-136-2-2中鉴定出一对新的显性抗性基因，命名为Bph10，并

17、定位在第12染色体上，与RG457相距3.68cM。Hirabayashi（1999）从药用野生稻中鉴定出两个新的隐性基因bph11和bph12，其中将bph11定位于第3染色体长臂上，与G1318相距12.4cM，bph12定位于第4染色体的G271和R93之间，遗传距离分别为2.4cM 和4cM。Yang等（2002）在阔叶野生稻中发现显性基因Bph12(t)，并将其定位于第4染色体上C946和RM261之间，和RM261之间距离为1.8cM。Renganayaki 等（2002）也发现，源自药用野生稻的一对新基因对生物型具有抗性，命名为Bph13(t)，并利用重组自交系( RILs) 和

18、RAPD 标记将其定位到第3染色体上。但与之不同的是，刘国庆等（2001）在紧穗野生稻发现一对显性主效基因,位于第2染色体,在两个微卫星标记RM240和RM250之间,遗传距离分别为6.1和5.5cM,暂时定名为Bph13(t)，对生物型、表达抗性。Huang等（2001）从带有药用野生稻背景的基因渗入系B5中鉴定了两个新的显性抗性基因，并运用RFLP技术，采用集团分离分析法将其中一个命名为Bph14(原名Qbp1)的基因定位于第3 染色体的G1318和R1925之间，2个分子标记相距3.2cM，另一个命名为Bph15(原名Qbp2)的基因定位于第4染色体的C820和S11182之间，2个分子

19、标记相距1.2cM。Sun等（2005）通过连锁作图和QTL分析发现Rathu Heenati携带抗褐飞虱的主效基因Bph17，并将其定位到4号染色体短臂上，与2个SSR标记RM8213和RM5953的遗传距离分别为3.6cM和3.2cM。Jena等（2006）从带有澳洲野生稻遗传背景的基因渗入系IR65482-7-216-1-2中鉴定出一对与Bph10不等位的新抗性基因Bph18(t)，定位在第12染色体长臂末端的两标记RM463和S15552之间。Chen等（2006）在籼稻品种AS20-1中发现抗褐飞虱隐性主效基因bph19(t)，并将bph19(t)精细定位到水稻第3染色体上标记RM6

20、308和RM3134之间约60kb的区间内，两标记的遗传距离约1cM。另外，Li等（2006）从1200余份普通野生稻Griff种质中编号2183的种质存在2对隐性抗性基因，分别定位于4号染色体和12号染色体上，这两对基因很可能是新发现的基因，也暂命名为bph18(t)和bph19(t)，bph18(t)被定位在水稻4号染色体上RM6506和RM273之间，遗传距离分别为11.0cM和6.0cM，bph19(t)被定位在水稻12号染色体上距RM17标记16.7cM的位置。Rahman等（2009）在小粒野生稻中发现了抗水稻褐飞虱的主效QTLBph20(t)和Bph21(t)，并将Bph20(t

21、)定位在水稻第4染色体短臂上193.4kb的区间内，将Bph21(t)定位在水稻第12染色体长臂上194.0 kb 的区间内。侯丽媛等（2010）在海南普通野生稻中检测到2个隐性褐飞虱抗性QTL,，暂命名为bph22(t)和bph23(t)，并将bph22(t)定位在第4染色体上RM8212和RM261之间，将bph23(t)定位在第8染色体RM2655和RM3572之间。Bph24(t)同样来自与野生稻中，但目前并未被定位（RAM et al 2010）。Yara等（2010）在ADR52中鉴定了Bph25(t)和Bph26(t)，并分别定位于第6染色体和第8染色体上。He等（2012）在栽

22、培品种Balamawee中鉴定出Bph27(t)，并将其精细定位在第4染色体上标记Q52和Q20之间,约63Kb的区间内。在所有的已定位褐飞虱抗性基因中，只有Bph14已被克隆。Bph14cDNA 全长9576bp，包含有3个外显子，编码一个由1323氨基酸组成的蛋白产物，产物包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列。Bph14在水稻的根、叶片和叶鞘的维管束中表达，而这些部位正是褐飞虱的摄食部位。Bph14不是通过排拒作用而是通过抗生作用来发挥抗稻飞虱的作用（范峰峰等 2014）。含Bph14基因的水稻在褐飞虱侵染后能激活水杨酸信号传导通路，诱导韧皮部细胞的胼胝质沉积以及胰蛋白酶

23、抑制剂的产生，从而降低褐飞虱的取食、生长速率和寿命（Bo等 2009）。2.5水稻抗褐飞虱基因的利用1973年，国际水稻研究所首次推出含抗褐飞虱基因Bph1的品种，后在1976年推出含bph2的抗性品种，有效的遏制了褐飞虱的大爆发，大大降低了水稻生产损失，但在种植多年后，这些品种的抗性消失，褐飞虱为害再次大爆发，农业生产受到严重影响。我国自上个世纪70年代以来，也同样育成了一系列的含抗褐飞虱基因的抗性品种，并在推广生产中有效地抑制了褐飞虱的为害。同时，在常规育种的基础上，采用分子标记辅助选择等技术有目的地进行抗性基因的聚合，从而选育出更持久有效的抗性品种。胡杰等（2010）通过MAS技术将抗褐

24、飞虱基因Bph14、Bph15 同时导入到汕优63的亲本明恢63、珍汕97B中，以改良汕优63的褐飞虱抗性。李进波等（2006）以药用野生稻渗入系B5为供体亲本，以9311、1826 为受体亲本，获得了目标基因Bph14、Bph15纯合的稳定株系。孙荣科等（2009）以携带bph2、Bph3 的水稻品系ME1为供体亲本与杂交稻亲本进行杂交、回交和自交，结合分子标记辅助选择，成功获得了双基因纯合的株系。就目前来看，抗褐飞虱品种选育的重点应是利用分子标记辅助选择等技术，有效的将多抗性基因聚合，培育多抗性基因聚合品种。三、研究内容（对拟开展的研究工作分层次进行详尽的描述）1、以携带褐飞虱抗性基因Bp

25、h14和Bph15的材料B5和华15为供体亲本，分别与R666进行1次杂交、3次回交和2-3次自交，每个世代用分子标记对Bph14和Bph15基因进行检测、同时进行农艺性状的表型选择，培育主要农艺性状与R666相似、同时携带Bph14和Bph15基因的株系；2、将选育出的新株系进行褐飞虱抗性鉴定，选择褐飞虱抗性3级（即抗级）的株系；3、 将抗褐飞虱的新株系与不育系Y58S等不育系进行组合测配，将配制的组合进行褐飞虱抗性和产量优势鉴定以及生育期、主要农艺性状、稻米品质等的分析，选择褐飞虱抗性强、产量高、稻米品质优、生育期适宜、主要农艺性状优良的杂交组合；4、在不同世代选择携带Bph14和Bph1

26、5基因、表型不同于R666的单株，创建新的抗褐飞虱恢复系材料；5、以携带Pi2基因的抗稻瘟病材料YAQ10242与携带Bph14和Bph15基因的株系杂交，通过基因聚合创建同时抗褐飞虱和稻瘟病的新恢复系材料。四、研究对象（试验材料）、研究方法（试验方法）与技术路线1、试验材料受体亲本R666，由安徽华韵生物科技有限公司提供；携带Bph14和Bph15基因的褐飞虱抗性供体亲B5由武汉大学提供、华15由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供；携带Pi2基因的稻瘟病抗性亲本YAQ10242是本课题前期创建的中间育种材料。2、研究方法2.1 分子标记辅助选择2011年3月在海南以R666为母本，分

27、别与B5、华15和YAQ10242杂交，并获得F1杂交种子；2011年5月在武汉种植杂种F1，经分子检测后，8月将真杂种与R666回交，获得BC1F1的种子；2011年11月在海南种植BC1F1，经分子检测后，2012年3月选择携带目标基因的单株与R666进行第二次回交，获得BC2F1的种子；2012年5月在武汉种植BC2F1，经分子检测后，8月选择携带目标基因的单株与R666进行第三次回交，获得BC3F1的种子；2012年11月海南种植BC3F1，经分子检测后，3月选择表型与R666相似、携带目标基因的单株自交，收获BC3F2种子；2013年5月种植BC3F2分离群体（此前工作由王笑见完成）

28、。2013年8月本人接收以上材料，经分子检测后，9月选择表型与R666相似、携带目标基因纯合的单株，收获BC3F3种子；2013年11月海南种植BC3F3家系，2014年3月继续选择单株，同时进行组合测配。2014年5月武汉种植BC3F4株系，苗期进行分子检测，选择目标基因纯合的株系与Y58S等不育系配组。采用CTAB法提取DNA样品用于实验室分子标记检测，具体步骤：水稻移栽后，取幼嫩叶尖2-3cm置于2ml离心管中，加入800l 1.5CTAB、钢珠，用Tissuelyser高通量研磨机研磨；后置于65恒温水浴30min以上；取出后加入与CTAB等体积的氯仿/异戊醇（241）混合液，置于摇床

29、振荡10-15min至下层液相深绿色止；后放入离心机中以10000rmp转速离心5min，至上层溶液澄清，再提取400450l上清液于1.5ml灭菌离心管中，加入1ml预冷95%乙醇，摇匀置于-20环境静置30min以上；后放入离心机中以12000rmp转速离心8min，倒去离心管内液体，用75%乙醇浸洗沉淀约10min，过夜自然干燥；最后加入100l灭菌纯水溶解备用。 PCR反应体系总体积为20l，其组成为：DNA模板2l，灭菌水13.6l，dNTP(5mM) 1.8l，Buffer(10) (Mg2+ plus) 2l，正反引物各0.24l，rTaq酶0.12l，扩增前加入18l矿物油，用

30、来保护反应体系。扩增程序：95预变性5min；然后每个循环：变性：94，30s，退火：55，30s，延伸：72，45s。循环数 35次，72延伸7min，25保温。PCR产物在4%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳中分离，后经硝酸银溶液、NaOH溶液染色显影。用于分子标记选择的引物如下：基因引物名称引物序列(5-3)PCR扩增产物大小bp参考文献Bph1476-2-FCTGCTGCTGCTCTCGTATTG170武汉大学提供76-2-RCAGGGAAGCTCCAAGAACAGRM5665-FCAAACCACTGTGAGTACGGC180武汉大学提供RM5665-RTTCTCACTTTGCTGTCA

31、GCGBph1515-6-FAGGTGAAGCTGATGTGCTTG175武汉大学提供15-6-RCGATACTTATTGCAACACACMS5-FTTGTGGGTCCTCATCTCCTC215武汉大学提供MS5-RTGACAACTTTGTGCAAGATCAAA2.2 褐飞虱抗性鉴定2014年5月初，将海南选择的BC3F4株系和测配的部分组合在武汉播种，进行褐飞虱抗性鉴定。2015年，将BC3F6株系和测配的部分组合再次进行褐飞虱抗性鉴定，选择褐飞虱抗性在抗级以上，农艺性状优良的株系和组合。主要采用在苗期进行褐飞虱抗性鉴定：每个待鉴定的材料准备30粒种子，浸种24小时后在30条件下催芽48小时

32、，同时将浸泡后的泥土装在边长7cm、高8cm、底部4个小孔的方形小塑料盒中，泥土深度6.5cm。将催芽的种子均匀播种在方形小塑料盒泥土表面，覆盖细土，每个小方盒播种1个材料，并插上标签。然后将方形小塑料盒放置在长50cm、宽35cm、高8cm的大塑料盒中，每个大塑料盒放置35个方形小塑料盒中，将大塑料盒灌满水。以抗褐飞虱的供体亲本B5作抗虫对照、以TN1和受体亲本作感虫对照，每个大塑料盒设置2套对照品种，均匀地放置在鉴定样品中。待秧苗生长到3叶期，进行间苗，保持每个小方盒中有12-15株健康的秧苗，用饲养好的2-3龄褐飞虱若虫进行人工接虫，平均每株秧苗接虫10-12头。评价方法分为单株观察和集

33、团观察两种方法。单株观察方法是：在2盆TN1都全部死亡时一次性观察，评价标准见表1-2，记录每棵秧苗的抗级，以平均值表示该材料的抗性表现水平。集团鉴定法是：当2个感虫对照TN1的死亡率达到95%时，记载鉴定材料的抗性反应，连续记载3天以上，直到TN1完全死亡为止，评价标准见表3。以连续记载的最高级别评价材料的抗性反应。表1 褐飞虱抗性单株评价记载方法抗性分数秧苗植株症状0植株健康，未受到伤害11叶片轻微发黄31-2片发黄或1片叶萎缩51-2片叶萎缩或1片叶枯萎73-4片叶萎缩或2-4片叶枯萎，但植株仍是活的9植株死亡表2 褐飞虱抗性单株评价平均数评价标准抗性分数抗性水平00.9免疫I1.01.

34、9高抗HR2.03.9抗R4.05.9中抗MR6.07.9中感MS8.09.0高感HS表3 褐飞虱抗性苗期集团评价标准抗性分数症状抗性水平0没有为害免疫I1非常轻的为害高抗HR3大部分植株的第1-2片叶部分发黄抗R5植株明显发黄和矮缩，或10-25%的植株枯萎或死亡和其他植株严重矮缩或即将死亡中抗MR7一半以上植株死亡中感MS9全部植株死亡高感S2.3 组合测配和优势鉴定2014-2015年分别在海南和武汉对测配的每个组合，种植30苗，密度56寸（16.720cm），2次重复，以Y58S/R666和湖北省区试对照组合作对照，进行产量、生育期、品质和主要农艺性状鉴定，选择与对照相似或更优的组合。

35、 2.4 农艺性状考察每个种植季节对所有材料记载见穗期（第一个稻穗抽出）、始穗期（10%稻穗抽出）、抽穗期（50%稻穗抽出）、齐穗期（80%稻穗抽出）和成熟期（80%稻谷成熟），计算播始历期（播种的第二天到始穗的天数），并与对照进行比较。成熟时每个材料取样3株，考察株高、有效穗数、平均穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重和单株产量等8个主要农艺性状。为了比较准确地测定产量，将取样后的小区混合收割、脱粒、晒干和称重，再加上取样单株的重量为小区的总产量，将总产量除以小区有效株数，计算小区的平均单株产量。2.5 稻米品质分析按照国家优质稻谷标准（GB/T17891-1999）测定方法，对育成

36、株系、杂交组合及对照组合进行稻米品种分析。使用BLH-3250砻谷机和JMNJ-3精白机测定糙米率、精米率及整精米率，使用JMWT12大米外观品质检测仪分析测定垩白粒率、垩白度、粒长及长宽比，最后将米粒打成米粉后过120目筛子，测定糊化温度、胶稠度及直链淀粉含量。3、技术路线近等基因系创建新株系和聚合株系创建近等基因系创建R666/B5(或华15) R666/YAQ10242F1 F2F2 F1R666/F1 R666/F1BC1F1 BC1F2BC1F2 BC1F1R666/BC1F1MF1R666/BC1F1 R666/BC2F1MF2R666/BC2F1BC3F1MF3BC3F1BC3F

37、2MF4BC3F2BC3F3BC3F4BC3F5BC3F6MF5MF6MF7BC3F3BC3F4BC3F5BC3F6组合测配、稻瘟病抗性鉴定，产量、生育期、农艺性状和稻米品质等的评价4、可能存在的问题及应对措施1）选出的株系可能表型与受体亲本有差异。这样的株系将作为新材料使用。2）选出的株系，表型与受体将作为新材料使用。3）如果褐飞虱抗性没有明显提高或者不亲本相似，但配合力不一样。也能达到中抗以上、但表现表现优良的株系，将用具有抗性的不育系进行配组。五、工作基础和已有进展1)利用Bph14，Bph15的SSR引物多态性分析和分子标记的辅助选择，筛选出了基因纯和的株系，并进行褐飞虱抗性鉴定。2)

38、将获得的Bph14和Bph15双基因纯和的株系进行海南配组计划，海南加代繁殖选择农艺性状好的阳性单株。 六、计划研究进度1、2013.8-10：进实验室学习基本的试验技术；2、2013.11-2014.1：海南播种、取样分子检测；3、2014.2-4：海南选择单株和组合测配；4、2014.5-10：武汉播种、分子检测、单株选择、组合测配、褐飞虱抗性鉴定；5、2014.11-2015.4：海南播种、组合优势鉴定、继续组合测配；6、2015.5-10：武汉播种、组合优势鉴定、株系农艺性状考察、稻米品质分析，继续进行褐飞虱抗性鉴定；7、2015.11-2016.2：数据整理；8、2016.3-6：论

39、文写作、毕业答辩。七、预期目标及本研究创新之处1、选育出褐飞虱抗性明显提高、表型和配合力与R666相似的恢复系株系2-4个；2、筛选出褐飞虱抗性明显提高，产量、生育期、稻米品质、主要农艺性状与Y58S/R666相似的组合1个；3、创建抗褐飞虱或多抗的恢复系新材料若干份；4、筛选出褐飞虱中抗以上、产量比区试对照组合显著提高、稻米品质优的苗头组合1-2个。八、主要参考文献1. 傅强，张志涛.2005年稻飞虱暴发情况、成灾原因及2006年控制对策A.中国科学技术协会,2006:42. 郝树广,程遐年,罗跃进.褐飞虱为害水稻不同生育期对产量的影响J.植物保护学报,1997,04:321-325.3.

40、程遐年,吴进才,马飞.褐飞虱研究与防治M.北京：中国农业出版社2003,38-424. 范峰峰,邱颖波,刘行丹,李绍清,刘建丰.水稻抗褐飞虱基因及其育种应用研究进展J.中国农学通报,2014,06:13-195. 侯丽媛,于萍,徐群,袁筱萍,余汉勇,王一平,王彩红,万国,彭锁堂,魏兴华.两个水稻抗褐飞虱隐性基因的遗传分析与初步定位J.中国水稻科学,2010,04:367-3716. 胡杰,李信,吴昌军,高冠军,肖景华,何予卿.利用分子标记辅助选择改良杂交水稻的褐飞虱和稻瘟病抗性J.分子植物育种,2010,8(6):1180-11877. 黄方能,程遐年.褐飞虱为害对水稻产量结构影响的研究J.中

41、国水稻科学,1990,03:117-1218. 姜人春.稻褐飞虱生物型的最新研究进展J.昆虫知识,1999,05:308-3129. 李进波,夏明元,戚华雄,何光存,万丙良,査中萍.水稻抗褐飞虱基因Bph14和Bph15的分子标记辅助选择J.中国农业科学,2006,9(10):2132-213710. 刘国庆,颜辉煌,傅强,钱前,张志涛,翟文学,朱立煌.栽培稻的紧穗野生稻抗褐飞虱主效基因的遗传定位J.科学通报,2001,09:738-74211. 吕亮,陈其志,张舒,荆胜利,何光存.水稻褐飞虱三种生物型间的生物学特性比较J.湖北农业科学,2011,23:4852-485512. 吕再萍,杨长举

42、,华红霞.武昌地区褐飞虱生物型鉴定J.湖北农业科学,2009,06:1369-137013. 孙荣科,陈乔,李孝琼,陈英之,韦绍丽,阳海宁,张月雄,李容柏.分子标记辅助聚合抗褐飞虱基因选育杂交水稻抗性品种初步研究J广西农业科学，2009,40(6):654-65714. 王桂荣,赖凤香,傅强,张志涛,郭兰芳.稻褐飞虱致害性变异的研究J.中国水稻科学,1999,04:229-23215. 巫国瑞,陈福云,陶林勇,黄次伟,冯炳灿.稻褐飞虱生物型的研究J.昆虫学报,1983,02:154-16016. 吴和生,李瑛,杨乃旺,杨乃召,李广泽.褐飞虱又一种危害方式及其损失估计J.昆虫知识,1994,31

43、(1):4-517. 肖英方,顾正远,邱光,陈明亮,刘学平,王强胜,肖英方.褐稻虱生物型变异特征与遗传方式研究J.江苏农业学报,1997,01:15-1818. 杨荣明.褐飞虱发生规律及防治方法J.农家致富,2011,15:36-3719. 张启发.绿色超级稻的构想与实践M.北京:科学出版社,2010,7-1620. 周亦红,韩召军.褐飞虱生物型研究进展:致害性变异的遗传机制J.昆虫知识,2003,03:199-20321. 祝莉莉,祝彩磊,翁清妹,黄臻,何光存.水稻抗褐飞虱基因的研究J.湖北农业科学,2004,01:19-2422. Athwal DS, Pathak MD, Bacalan

44、gco EH, Pura CD. Genetics of resistance to brown planthopper and green leafhopper in Oryza sativa L. Crop Science,1971,11(5): 747-75023. Chen JW, Wang L，Pang XF, Pan QH.Genetic analysis and fine mapping of a rice brown planthopper (Nilaparvata lugensStl) resistance genebph19(t).Molecular Genetics an

45、d Genomics ,2006,275(4): 321-32924. Du B, Zhang WL, Liu BF, Hu J, Wei Z, Shi ZY, He RF, Zhu LL, Chen RZ，Han B, He GC.Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(52): 22163-2216825.

46、 He J, Liu YQ, Liu YL, Jiang L, Wu H, Kang HY, Liu SJ, Chen LM, Liu X，Cheng XN, Wan JM.High-resolution mapping of brown planthopper (BPH) resistance gene Bph27(t) in rice (Oryza sativa L.)J. Molecular Breeding,2012, 31(3):549-55726. Hirabayashi OT.Identification and utilization of DNA markers linked

47、 to genes for resistance to brown planthopper(BPH) in rice. Recent Advance Breeding Science,1999,41:71-7427. Huang Z, He G, Shu L, Li X, Zhang Q.Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theoretical and Applied Genetics, 2001, 102(6-7) : 929-93428. Ishii T, Brar D

48、S, Multani DS, Khush GS.Molecular tagging of genes for brown planthopper resistance and earliness introgressed fromOryza australiensisinto cultivated rice,O. sativa. Genome,1994,37(2): 217-22129. Jairin J, Sansen K, Wongboon W, Kothcharerk J. Detection of a brown planthopper resistance gene bph4 at

49、the same chromosomal position of Bph3 using two different genetic backgrounds of rice. Breeding Science,2010,60(1):71-7530. Jena KK, Jeung JU, Lee JH, Choi HC, Brar DS.High-resolution mapping of a new brown planthopper (BPH) resistance gene, Bph18(t), and marker-assisted selection for BPH resistance

50、 in rice (Oryza sativa L.) .Theoretical and Applied Genetics, 2006, 112(2): 288-2931. Kabis MA, Khush GS. Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice (Oryza sativa L.). Plant Breeding, 1988, 100(1): 54-5832. Khush GS, Karim ANMR, Angeles ER. Genetics of resistance of rice cultivar AR

51、C10550 to Bangladesh brown planthopper biotype. Journal of Genetics, 1985, 64(2-3):121-12533. Lakshminarayana A, Khush GS. New genes for resistance to brown planthopper in rice. Crop SCI 1977, 17: 96-10034. Li RB, Li LS, Wei SM, Wei YP, Chen YZ, Bai DL, Yang L, Huang FK, Lu WL, Zhang XJ, Li XY, Yang

52、 XQ, Wei YW.The Evaluation and Utilization of New Genes for Brown Planthopper Resistance in Common Wild Rice (Oryza rufipogon Griff). Molecular Plant Breeding, 2006, 4(3): 365-37135. Nemoto H, Ikeda R, Kaneda C.New genes for resistance to brown planthopper, Nilaparvata lugens Stl, in rice. Japanese

53、Journal of Breeding, 1989, 39(1):23-2836. Qiu YF, Guo JP, Jing SL, Zhu LL, He GCHigh-resolution mapping of the brown planthopper resistance gene Bph6 in rice and characterizing its resistance in the 9311 and Nipponbare near isogenic backgrounds. Theoretical and Applied Genetics, 2010,121 (8):1601-16

54、11.37. Rahman MD, Jiang WZ, Chu SH, Qiao YL, Ham TH, Woo MO, Lee JH, Khanam MS, Chin JH, Jeung JU, Brar DS, Jena KK, Koh JH.High-resolution mapping of two rice brown planthopper resistance genes, Bph20(t) and Bph21(t), originating from Oryza minuta. Theoretical and Applied Genetics, 2009, 119(7): 1237-124638. Ram T, Deen R, Gautam SK, Ramesh K, Rao YK, Brar DS.Identification of new genes for Brown Planthopper resistance in rice introgressed from O. glaberrima and O. minuta. Rice Genetics Newsletters,2010,25(4): 67-6939. Renganayaki K, Fritz AK, S