DNA提取过程中各种试剂的作用及原理

1、DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1 溶液I 溶菌液:溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的B -1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制 葡萄糖：增加溶液的粘度,维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解EDTA( 1)螯合Mg2、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA勺降解作用(DNase 作用时需要一定的金属离子作 辅基)；(2) EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2. 溶液 II NaOH-SDS液:NaOH核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳定的。 但当pH>

2、 12或pHv 3时，就会引起双链之间 氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为/L,加抽提液时，该系统的pH就高达，因而促使染色体 DNA 与质粒DNA的变性。SDS SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1) 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2) 解聚细胞中的核蛋白。(3) SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R+ -蛋白质的复合物，使 蛋白质变性而沉淀 下 来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止 在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。3. 溶液III-3mol /LNaAc()溶液：Na

3、Ac的水溶液呈碱性，为了调节 pH至，必须加入大 量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc的缓冲液。用的NaAc溶液是为了把的抽提液，调回 pH至 中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3mol/LNaAc有利于变性的大分子 染色体DNARNA以及SDS蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互 相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完 全。4. 为什么用无水乙醇沉淀 DNA用无水乙醇沉淀DNA这是实验中最常用的沉淀 DNA勺方法。乙醇的优点是可以任意比和 水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应

4、，对 DNAK安全，因此是理想的沉淀剂。DNA容液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA周围的水分子，使 DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加 2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最 终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增 大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代 替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA一般在室温下放置15- 30分钟

5、即可。5. 在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达L?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc或NaCl，使Na冲 和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成 DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太 高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA的酶切等反应， 必须要进行洗涤或重沉淀。6. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与 KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质

6、，为了纯化 DNA又必须去除之，加SDS可使它们成为 SDS蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS蛋白质 复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase在溶液中，有 人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。7. 为什么在保存或抽提 DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰 作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=）和硼酸系统（pKa=）等虽然也都符合细胞内环境的生理 范围（pH），可作DNA勺保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4

7、）2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要 求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl （pKa=的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris ，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA寸，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开， 异戊醇的作用是消除抽提过 程中出现的泡沫。氯仿是强蛋白质变性剂，抑制 RN酶的活性，除去蛋白质污染基因组DNA-CTA法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide

8、, 十六烷基三甲基溴化铵 ）, 是一种阳离子去污 剂, 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性 .在高离子强度的溶液中 （LNaCl）,CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物 ,只是不能沉淀核酸 通过有机溶剂抽提 ,去除蛋白 ,多糖, 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 .注:CTAB溶液在低于15C时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15C.基因组DNA-CTA法CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl 提供一个缓冲环境 , 防止核酸被破坏 ;EDTA螯合Mg2+或 Mn2离子,抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境,使D

9、NP充分溶解,存在于液相中；CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离；B -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA-CTA法CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚, 减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合,有效去除多糖基因组DNA勺提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离 DNA寸，应提供相应的缓冲 体系采用有机 （酚/氯仿）抽提时应充分混匀 , 但动作要轻柔离心分离两相时 ,应保证一定的 转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组 DNA的提

10、 取核酸分离 , 纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS,异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理核 酸分离 , 纯化多糖的去除：高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl,高盐可溶解 多糖. 用多糖水解酶将多糖降解 . 在提取缓冲液中加一定量的氯苯 （1/2 体积）, 氯苯可以与 多糖的羟基作用,从而去除多糖用PEG8000代替乙醇沉淀 DNA在 500卩LDNA液中加入 200卩I20%PEG8000含,冰浴20min.核酸分离，纯化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：B -巯基乙醇，抗坏血酸，半胱氨酸，二 硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP聚

11、乙烯吡咯酮）,PEG（聚乙二醇）,它们与酚类 有较强的亲和力,可防止酚类与DNA勺结合盐离子的去除 ：70%的乙醇洗涤核酸吸附 , 沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸 , 其它 的杂质均被洗掉，达到纯化DNA勺目的另一种方式加入1/10体积的NaAc,3M）,用预冷的乙 醇或异丙醇沉淀 RNA吸附或沉淀后应用70%勺乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议 使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2或Mn2离子,抑制DNasepH值为,可防止DNA 发生酸解。基因组DNA提取常见问题DNA中含有蛋白,多糖,多酚类杂质DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应 DNA 中残留有金属离子有 RNA的存留原因对策重新纯化 DNA过吸附柱去除蛋白，多糖,多酚等 杂质重新沉淀DNA让酒精充分挥发增加70聽醇洗涤的次数（2-3次）加入RNase降解RNA 冋题一一:DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应.DNA提取常见冋题材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料 , 低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后 , 应在解冻前 加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA