质粒DNA提取纯化及验证

1、【实验目的】1、掌握碱变性提取质粒DNAy勺原理、过程及各种试剂的作用。2、掌握凝胶电泳对DN吩离纯化的原理和方法。【实验原理】1、提取、纯化质粒DNA（碱变性提取法）提取和纯化质粒DNA勺方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、 羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化葩密度梯度离心法和 Wizard法等。其中，碱变 性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA勺提取。该方法操作简单，易于 操作，一般实验室均可进行。提取的质粒 DNA屯度高，可直接用于酶切、序列测 定及分析。碱变性提取质粒DNA-般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质 粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染

2、色体DNAiZ双螺旋结构存在，质粒DNAO共价闭合环状形 式存在。细胞破碎后，染色体DNAffi质粒DNA匀被释放出来，但是两者变性与复 性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12. 0的碱性溶液中，染色体DNA勺氢 键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA勺大部分氢键断裂，但 两条互补链不完全分离。当用pH值4. 6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液 至中性时，变性的质粒DNAM恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液 中；但染色体DNA能复性，而是与不稳定的大分子 RNA蛋白质一 SDSM合物 等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液

3、的质粒DN的离。溶于上清液的质粒 DNA可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚 而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀 DNA的同时，也伴随着 RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA窜解。质粒DNA容液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。2、琼脂糖凝胶电泳电泳 （ electrophoresis） 是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的

4、大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DN*段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如澳化乙锭 （EB）或SYBR Gold染色直接观察 到，甚至含量少至20 Pg的双链DNAft紫外激发下也能直接检测到。需要的话， 这些分离的DN标带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易

5、于操作，适用于核酸电泳，测定DNA勺相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA>t段，进一步纯化DNA0琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNAt琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6 个因素：1）样品DNA子的大小：电泳时，线性双螺旋DN的子是以头尾位向前迁移的， 其迁移速度与相对分子质量（ 所含碱基） 的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。2）DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的 DN吩子，其迁移速率 不同。在抽提质粒DNA1程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状 结构的质粒 DNA（covalen

6、tly closed circular DNA, cccDNA）B一条链断裂，变成开环DNA（open circle DNA , oeDNA分子，如果两条链发生断裂，就转变为线 状DNA（1iner DNA, L DNA份子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况 下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNAt段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNAt泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DN*段的迁移速率与所用

7、电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度 DN呼动 的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA 勺有效围随着电压上升而减少。为了获 得DNAt段的最佳分离效果，电场强度应小于 5 V/cmr5） 缓冲液： 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水（ 如不慎误用去离子水配制凝胶） ，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10X电泳缓冲液），导电性极高，带电颗 粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DN尬性。电泳时常用的缓 冲液有乙酸盐（TAE、硼酸盐（TBE剂磷酸盐（TPE几种不同的缓冲液，通常配制成10X

8、或5X的浓度母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失（阳极变碱性，阴极变酸性），长时间电泳需要更换缓冲液。TAEg冲液可以分离数KB长度的DNA在精致DNAt段以 及染色体DNA8行杂交时经常使用6）温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小 DNA片段的相对电泳迁移率在 430无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0 5时，凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。【实验仪器、材料及试剂】1、仪器和材料接种环， 培养皿， 酒精灯， 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，微量移液器及多型号枪头，微波炉，电泳仪等菌体：E.coli

9、 DH5a受体菌,具有Amp标记的质粒pUC19Maker:X / Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker点样对照组：pUC19/ Hind II双链线性DNA PUC19 （商品）入DNA2、实验试剂LB培养基，抗生素（氨苇青霉素），溶液I ,溶液H,溶液田，3mol/L NaAc 溶液，预冷无水乙醇，70猿醇溶液，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/ 异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，TAE电泳缓冲液（10X）澳化乙 锭（EB）,上样缓冲液（6X）溶液 I: 50mMi 萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0） , 10mM E

10、DTA（pH 8.0。（1M Tris-HCl , 12.5ml pH 8.0; 0.5M EDTA10ml pH 8.0 ,葡萄糖 4.730g,力口 ddH2O 至500ml。在121c高压灭菌15min ,贮存于4 C）0溶液H: 0.2M NaOH 1% SDS （使用前用10M的NaOHffi 10%勺SDS母液配 置，防止NaOHR收空气中的H25口 CO2m减弱了碱性）。溶液田：5M醋酸钾（KA。缓冲液60ml,冰醋酸11.5ml ,重蒸水28.5ml ,溶液中浓度K+3M,Ac-5M。【实验步骤】1、扩增质粒（菌体培养）1 ）在LB平板上划线培养具有 Amp标记的E.coli

11、DH5x菌，37c恒温倒置 培养16-18hr ;之后，挑取单菌落，接种于20ml LB液体培养基（含Amp80ug/ml） 中，37C, 220rpm振荡培养过夜12-14hr ;再转接一次，进行50或100倍稀释， 同样37 C, 220rpm振荡培养4-6hr。2）对50mL的离心管称重（记为m）,取菌液30ml配平，6000rpm离心5min, 弃去上清液；加入5ml溶液I混匀，6000rpm离心5min,弃去上清液。取离心管 称重（记为m2） ，可测得菌体重量W=m2-m1。2、提取质粒1）向离心管中加入溶液I （ 1.0ml/100mg菌体），漩涡混匀后，冰浴5min；向离心管中加

12、入溶液H （2.0ml/100mg菌体）,轻柔颠倒混匀后，冰浴5min； 向离心管中加入溶液田（1.5ml/100mg菌体）,轻柔颠倒混匀后，冰浴5min； 离心管配平，12000rpm离心15min,取上清至新50ml离心管（记体积为v1） 2 ）加入2vi冰乙醇，颠倒混匀，-20C保存30min, 12000rpm离心15min,弃上 清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。向沉淀中加入5mL70崂醇进行洗涤，12000rpm离心2min,弃去上清液，重复洗涤一次；37 C下保存5min,至离心管干燥，加入1mlTE缓冲液溶解，得粗提物，将粗 提物转移至新EP管，加入100ugRNa

13、seA （10ug/ul）,将EP管放置于37c下，保 温 1-2 小时。3、纯化质粒1 ）将提取物等分为500ul置于EP管中，加等体积酚液，混匀后，12000r离 心5min,将上清液转移至新EP管；加入等体积酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，混 匀后，12000rpm离心5min,转上清至新EP管；加入等体积氯仿/异戊醇混合液， 混匀后，12000rpm离心5min,将上清液转移至新EP管；2 ） 加入 1/10 体积的 3mol/L NaAc， 混匀后，加入 2倍体积 （包括上清液和1/10体积的NaAc）的冰乙醇，颠倒混匀，-20C保存30min, 12000rpm离心15min,弃

14、 去上清液；加入 5mL70喔醇进行洗涤，12000rpm离心2min,弃去上清液，重复 洗涤一次；37 下保存5min, 至沉淀干燥, 每管加入25ul TE 溶液 , 温和振荡几秒钟，至沉淀溶解。将2管整合到一管，得到50ul质粒DNAA,放置-20 C下保存。4、凝胶电泳分离质粒1 ）制胶：1%琼脂糖凝胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40ml 1 >TAE微波炉加热至完全溶化，冷却至 60c左右，三角瓶放在手面可坚持 1min 即可，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1>TAE,即可上样。

15、2 ）取3.0膜 纯化DNA1口入1.0膜 上样缓冲液，混合，进行点样。点样完毕 后，100V, 200mAM牛下电泳30min。电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪 拍照，得到实验结果。【注意事项】1、在接菌时，注意无菌操作，物品应在酒精灯火焰上方无菌区域。将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触，然后轻轻摇动三角瓶，让液体的LB 培养基轻轻冲刷菌体，当观察到附近的LB 培养基有轻微浑浊现象时，接菌成功，再 轻轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中。2、注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。离心结束后， 将离心管从离心机取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。3、为

16、获得高纯度质粒DNA必须彻底除去杂蛋白、染色体 DNA口 RNA在整 个提取过程中出去染色体 DNA勺关键步骤是加入溶液H、溶液田的变性和复性环 节，应控制好变形和复兴的时机。加入溶液I时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变 成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液II时，菌液变 粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液田时，会立即出现白色沉淀。加入溶液R和 溶液田后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在漩涡振荡器上剧烈震荡，否则， 染色体DN哈断裂成小片段，不会形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA昆合 在一起，不利于质粒DNAS纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的 方法，既要使试剂

17、与染色体 DNAS分作用，又不破坏染色体的结构。4、酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。5、沉淀DNAffi常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNAK淀完全。除用乙醇沉淀 DN做卜，还可使用0. 6倍体积的异丙醇，但异丙醇也能 将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进行，并且时间不宜太长( 限 20 min) 。沉淀离心后，需用70乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。、6、在低温下提取质粒DNA收率较高。对于低拷贝治理，在收集细胞之前，用氯霉素适当处理，可以提高质粒的拷贝数。7 、制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在

18、微波炉里加热时间过长，否则溶液将会爆沸蒸发，影响琼脂糖浓度，可在微波炉中间歇性加热，约沸腾三次后，至凝胶溶解即可。同时， 制胶时要将凝胶槽中的水擦拭干净，避免对胶的均一性产生影响。8、电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳效果。如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液，并且，配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与电泳时使用的缓冲液为同一批配制的。9、凝胶冷却过程中，要自然冷却，不要用冷水冲，否则会导致凝胶各部分不均匀，对电泳结果产生影响10、 注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。11、 紫外线对眼睛和皮肤均

19、有危害性，对眼睛尤甚。为了最大限度避免受到辐射， 要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜（ 眼罩） 或能够有效阻挡紫外线的全副完全罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。12、澳化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA£ RN吩子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。【实验结果】（一）实验现象及数据记录1、灭菌干燥离心管质量：m 1=15.711g；菌液离心后离心管质量：m

20、 2=15.807g；菌体质量：W=0.0960g；2、加入溶液I时，剧烈震荡后，菌体沉淀转变成均匀浑浊的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液R时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留，打开EP管时，可以看到粘稠的丝状物。加入溶液田时，立即出现白色絮状沉淀, 经轻柔混匀后，沉淀漂浮在 EP管上部。3、电泳时可以明显观察到蓝色条带在电泳槽里由负极向正极移动，这是因为DNA螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根。所以，电泳时必须注意凝胶摆放的位置，应将点样孔靠近负极方向摆放。（二）凝胶电泳结果凝胶电泳观察结果图从左至右各泳道的样品及上样量泳道12345121314151617样品入/ Hind

21、iIIpUC19/HindlllpUC19（商品）JD-1JD-2JD-9JD-10入DNAJD-5(-)JD-7(-)DL2000样量（记）10.0100ng100ng3.03.03.03.06.03.03.05.0（三）结果分析1、凝胶电泳时，使用了 2种DNAMaker,分别为位于第一泳道的人/Hind III 和位于最后一泳道的DL200。其中，入/ Hind III DNA Maker可由HndI II酶 切Lambda/t得到的，本应有8条带，最后一条带大小约为125bp,实验中一般很 难观察到；DL2000DNAMarker是由单独的PCRT增产物混合而成，包括6条DNA 条带，

22、其DNAt段相比人/Hind III DNA Maker要小，适用于比对较小的 DNAt 段。（2种Maker所含DNAft带大小已在上图标记）。2、质粒DNAE取过程中，染色体DNA蛋白质、RNA?物质仍有部分残留， 质粒DNAt超螺旋、开环、线性三种不同的状态，这些因素导致实验组中每种样 品都可以观察到多条带。下面以我们组（JD-4）为例，通过横向对比，由上至下 对每一条带进行分析：1）蛋白质条带：点样孔附近可以观察到其周围有微弱荧光，表明纯化后的质粒DNAW含有少量蛋白质。电泳时，由于蛋白质分子较大，很难通过琼脂糖分 子筛，所以残留在点样孔处。残留的蛋白质经EB染色后，在紫外下可看到荧光

23、， 由于含量比较少，所以荧光比较弱。2）染色体DNA带：在点样孔至23130bp的条带间可以观察到微弱的条带， 其条带位置同样与14泳道的入DNA®近，该条带代表的是残留的染色体 DNA具 分子量比质粒DNA*很多，所以在琼脂糖凝胶中移动速度较慢，条带靠近点样孔。3）三种构型质粒DNAfrt：在4361bp至2000bp条带间可以看到两条带：上面一条颜色很浅，条带大小在 4300bp左右，为开环DNA子；下面一条 颜色很亮，条带大小接近1900bp,与第三泳道的PUC19B与同一水平，为超螺 旋DN吩子。与第二泳道的pUC19/ HindIII对比，可以推测在两条带间应还有线性DNA

24、分子条带，大小接近2500bp。正常情况下，由于没有专门的限制酶 切割DNA子，所以线性DN吩子比较难形成。在细菌体，质粒DNA1以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构 型的同一种质粒 DNA尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中跑在最 前沿的是共价闭合DNA其后依次是线性DNA和开环DNA其原因是共价闭合的 DNAM空间位阻最小，所以跑得最快。而开环DNA®间位阻最大，所以跑得最慢。4）RNA条带：图示中第15和16泳道为未加RNAB的样品，可见在500-100bp 围有宽而亮的条带，该条带为 RNAft带。本组中，均加过RNA酶，RN的解比较 彻底，仅在100bp

25、左右有一条很模糊的带。（四）实验小结综合以上分析，可以看出我们组（JD-4）的实验结果所得的质粒 DNA屯度还算理 想。染色体DNAF口双链开环DN*量少，蛋白质含量相对多一些。质粒DNAfrt 比较亮，其亮度大约为商品PUC19勺3-4倍，故可以推测，提取的质粒DNAt度 为PUC1寐度的3-4倍。【思考】1、质粒提取过程中，实验重要试剂及操作步骤的意义和作用。溶液I的作用：葡萄糖使溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止 DNAS机械剪切力作用而降解。EDTA是CeT和M0+等二价金属离子的螯合剂，可抑制 DNase的活性，抑制微生物的生长

26、。 Tris-Cl 溶液提供适当的pH。溶液II的作用：NaOHt细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle （微 囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体 DNA质粒DNAffi蛋白 质变性；SDS»下一步沉淀做铺垫。溶液田的作用：十二烷基硫酸钠(SDSsodium dodecylsulfate )遇到KAc后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS ),而 PDSll水不溶的， 因此发生了沉淀。又 SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SD的子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，此 外大肠杆菌的基因组DNAfe一起被共沉淀了。 HAc中和NaOH因为长时间的碱 性条件下会打断基因组 DNA只要是50-100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDStt沉淀了。同时变性的质粒DNAM性。该步反应形成的高盐环境进一步加速 了这一沉淀。冰浴使反应更充分。冰乙醇作用：用无水乙醇沉淀DNA这是实验中最常用的沉淀DNA勺方法。乙醇 的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA艮