微生物多样性之肠道微生态整体研究方案

1、高通量测序分析高通量测序分析对于微生物群落多样性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq等第二代高通量测序平台，对核糖体DNA高变区域，比如16S/18S/ITS等序列；或功能基因，比如细菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析，揭示环境样品中众多不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。高通量高通量测序优势测序优势1.测序通量高，可检测到环境样品中的痕量和微量微生物。2.PCR产物可直接进行测序，结果稳定，重复性强，实验周期短。3.微基生物开发了一套稳定的多样本平行测序实验方案，解决了样本间数据量不平衡的技术难题，一次

2、可实现上百个样品的平行测序。4.微基生物采用顶级期刊杂志Science中2012年7月发表文献中的低偏差扩增（LEA-SeqLEA-Seq）方法构建文库，更真实的还原样本中微生物的分布比例。5. 微生物群落多样性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq两种高通量测序平台可供选择，根据不同的测序要求提供不同的解决方案。6.专业的生物信息学分析人员，真实准确的对测序结果进行数据分析，针对客户的不同需求，提供专业的分析流程和结果。生物信息学分析流程生物信息学分析流程【初级篇】微生物多样性研究常用分析方法介绍杂乱序列OTU1OTU2OTU3OTU4热图【高级篇】微生物多样性研

3、究高级分析方法介绍肠道微生态整体研究方案 Tingting Wang等采用454测序技术研究结直肠癌（CRC）患者与正常人群肠道微生物的菌落组成差异。并结合real-time PCR对相关基因进行分析，最终确定丁酸盐产生菌的减少和一些致病微生物的增加使得CRC患者肠道微生物菌落的失衡。 Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. 2012. The ISME Journal研究对象： CRC患者46人，健康人群56人研究区域：V3区测序平台

4、：Roche 454 GS FLX案例：结直肠癌与肠道微生物结直肠癌与肠道微生物主要结果案例：结直肠癌与肠道微生物结直肠癌与肠道微生物（1）PCA主成分分析（图a）和PCoA主坐标分析（图b）显示CRC患者与正常人肠道微生物存在差异。蓝色圆圈代表正常人，红色圆圈代表CRC患者主要结果案例：结直肠癌与肠道微生物结直肠癌与肠道微生物（2）对CRC患者与正常人样本在98%相似水平上OTU的相对丰度进行RDA分析，找到健康人群与CRC疾病患者相关的微生物类群，进行分析与CRC疾病相关的主要微生物类群。有48个OTU可以作一个关键变量与CRC患者和正常人肠道微生物结构差异存在显著相关性。主要结果案例：结

5、直肠癌与肠道微生物结直肠癌与肠道微生物（3）Heatmap分析：48个OTU的相对丰度作为健康人和CRC患者肠道微生物差异的主要变量，他们在样本中的分布情况见下图。图左侧黑色OTU代表在正常人中相对丰富，红色OTU代表在CRC患者中相对丰富，每个样本的颜色强度代表在所有样本中的相对比率。肠道微生态整体研究方案Larsen等研究二型糖尿病患者肠道微生物与非糖尿病人群的差异，采用454测序技术结合qPCR技术对36个样本肠道微生物进行分析，结果表明二型糖尿病患者厚壁菌门和唆菌纲微生物比例较对照组显著降低，但是变形菌纲微生物丰富。Bacteroidetes与Firmicutes的比例、Bactero

6、ides-Prevotella group 与 C. coccoides-E. rectale group的比例与血糖浓度呈正相关，而与BMI（体重系数）无关。变形菌纲微生物同样与血糖浓度呈正相关。Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults. 2010. PLoS One.研究对象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人研究区域：V4-V6区测序平台：Roche 454 GS FLX案例：二型糖尿病与肠道微生物二型糖尿病与肠道微生物主要结果案例：二型糖尿病与肠道微生物二型

7、糖尿病与肠道微生物（1）Rarefaction Curve：确定取样深度是否合理。主要结果案例：二型糖尿病与肠道微生物二型糖尿病与肠道微生物(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者与正常人肠道微生物在门与纲水平的差异。肠道微生态整体研究方案为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响，Filippo CD等人比较了15个健康欧洲孩子（EU）及14个健康非洲农村孩子（BF）肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西方特色，而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个粪便样品进行高通量测序。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门（Actinobac

8、teria），拟杆菌门（Bacteroidetes），壁厚菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria），然而它们在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部分，而壁厚菌所占比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高。Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. 2010.PNAS.研

9、究区域：V5-V6区测序平台：Roche 454 GS FLX案例：饮食与肠道微生物饮食与肠道微生物主要结果案例：二型糖尿病与肠道微生物二型糖尿病与肠道微生物EU（健康欧洲孩子）和BF（健康非洲农村孩子）样本中微生物分布统计 A：BF样本中主要微生物的分布统计；B：EU样本中主要微生物的分布统计； C：全部样本相似性分析；D：各样本中主要微生物相对丰度统计； E：各样本中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的相对丰度统计肠道微生态整体研究方案Turnbaugh PJ等人对胖瘦不同的同卵双胞胎（31对）、异卵双胞胎（23对）及其母亲（46个）共154个个体的肠道微生物进行了研究。结果表明肥胖与肠道门级微生

10、物的变化相关，胖人与瘦人相比，微生物多样性明显降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例较低而放线菌门（Actinobacteria）所占比例较高。A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature.研究区域：V2和V6区测序平台：Roche 454 GS FLX案例：肥胖与肠道肥胖与肠道微生物微生物主要结果案例：肥胖与肠道微生物肥胖与肠道微生物1）A：不同胖瘦程度个体中主要门级别微生物分布及样本之间相似性水平分析； B：第一主成分与主要拟杆菌门（Bacteroidetes）的相关性分析； C：双胞胎之间，双胞胎与母

11、亲，不相关个体之间微生物功能相似性分析。主要结果案例：肥胖与肠道微生物肥胖与肠道微生物（2）根据随机序列取样与物种多样性分析图显示：肥胖人较瘦人体内微生物多样性显著降低。肠道微生态整体研究方案案例：不同个体肠道微生物群落结构不同个体肠道微生物群落结构人体肠道微生物群落结构在婴幼儿、成年人和老年人这三类人群中具有显著的差异，这表明随着年龄的增长，肠道菌群也历经了巨大的变化。Claesson MJ等人收集了161位65岁以上老人及9位成年人肠道菌群的样品，进行焦磷酸测序。研究发现68%的个体肠道中最优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes），平均比例约为57%，壁厚菌门（Firmicutes

12、）所占比例约为40%。但是和一些疾病或健康相关的菌群在不同个体中所占比例差别极大，包括变形杆菌门（Proteobacteria）,放线菌门（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物组与年青人也有鲜明差异，前者拟杆菌属所占比例更大，梭菌属在两者之间具有不同的丰度模式。分析26组time-0和time-3 month粪便样品，发现85%的个体在这两个时间的微生物组成极其相近，这表明老年人的肠道菌群呈现出时间稳定性。Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly. 2011. PNAS.研究区域：V4区测序平台：Roche 454 GS FLX主要结果案例：肥胖与肠道微生物肥胖与肠道微生物A：本研究老年人与青年人粪便中核心微生物在