细胞免疫组化

1、细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1. 细胞爬片， 5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。2. PBS 清洗标本 3 次 各 1 min 。3 .冰丙酮固定 15 min（ 或 4%多聚甲醛固定 30min） 。4. 空气干燥 5min 。5. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。6. %Triton X-100（ DPBS 配 ） 孵育 1 次 20min 。7. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。8 .3%H2O2 （试剂 A）孵育 15 min。9. DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。10. 封闭血清孵育（试剂 B） 20min 。11 .一抗孵育（滴度1: 20

2、0,湿盒）4C 过夜或37 C 60 min阴性对照最好用一抗来源血清，否则用 PBS 液12. PBS清洗标本3次各5 min。13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C） 37 C 30 min。14 .PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。15. 试剂 D （湿盒）37 C 30 min。16、PBS 清洗标本 3 次 各 5 min 。17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色） 约 310min18、蒸馏水洗 2 次 1 min 。19、苏木素复染 1min 。20、自来水洗返蓝。21. 梯度酒精脱水 75，85，95，100%各 3min 。22. 二甲苯透明 2 次 3min 。23、

3、中性树胶封片。注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良 好细胞爬片须注意以下：a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b接种的细胞密度适中以 2*104/ml为宜，若密度太高5天后 细胞连接成片冲洗时易脱片；2、 冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C 冰箱，冰丙酮固定时 会使细胞收缩，可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。3、 冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易 脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂 质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对

4、于抗原表达在 胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1. 如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些， 但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在 24 孔，或 6 孔 板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看 细胞本身的荧光。2. 孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色 后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油） 。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞 贴在玻片上爬片。3. 我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是 很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞

5、悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面 张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴 壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7 个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下， 到固定时细胞生长到 80左右比较合适。 偶是在盖玻片上做的， 首先细胞要爬的匀一些，象 dongwp 战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子 或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要， 在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。细胞爬片的保存和抗原修复问题总结1. 细胞爬片可以用 含叠氮钠PBS液保存.但不知道具 体浓度,请

6、告知多谢!加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为。但是我 建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的 问题！2. louischen wrote:但我的细胞爬片经过 4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了 -20度，还能用于免疫组化吗?!应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的 丢失3. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定，固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存4. 如果是4%多聚甲醛固定，然后放在 PBS中保存，在 4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。5. 丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过 夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固

7、定过度，会影 响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原 出现假阴性结果，可考虑应用 的triton-100孵育30分钟， 渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原 修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6. 丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备 用。7. 细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟(2) 4%多聚甲醛固定，室温，20分钟(3) 70%-80%-90%-95%-100% 梯度酒精脱水， 通风橱内 干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信 号，不过还是保存时间短一点的好8. 我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后，就放在室温中

8、，因为是要拍电镜，但是学校电镜坏了 ，呵呵，所以 放了一个月后去拍，还是很好9. 细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。10. 细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70 °C 长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰 预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用 PBS 冲洗，在做以后的步鄹11. 我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似 的问题。细胞培养好后用 PBS

9、洗一遍，然后 4% 多聚甲醛 4 度固定 15 分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。 我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏 感，有的差一些。 最好避光保存在 4 度，同时尽量隔绝空气。 免疫荧光与普通 DAB 显色差别只再二抗的标记，样品的保 存应该是没有多大差别的。12. 细胞爬片丙酮固定后 -20 度保存，现在要再做免疫荧 光，将保存的爬片拿出 37 度复温然后常规操作就可以了13. 爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保 存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能 是： 1）试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2）加一抗前处理同石蜡切片， 可进行抗原

10、修复， 如胰酶消化或热修复。 3）因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片 充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决 你的问题请 QQ 联系：。本人在湖南省肿瘤医院病理科 （长沙 市）做免疫组化。14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精 的，固定好后放 -20 度，2-3 个月是没有问题的。15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片 用冰的纯丙酮固定 20MIN ，再在通风柜将丙酮吹干， -20 度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强， 保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固 定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固

11、定剂。如如: 1.多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫电镜；也可用于 免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等2乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点： 但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较 差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度3甲醛（福尔马林）应用最广 优点：形态结构保存好， 且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或 完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴 性的染色结果

12、。16. 4度是不能保存这么长时间（1个月）的，如果抗原已 被分解，再修复也没用！17. 弃去固定液，不用 PBS洗而是采用空气干燥，干燥 后的标本可于-70 C长期保存。18. 爬片置于37度PBS中洗三次，每次 3到5秒钟， 然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在 载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续 实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太 清楚，

13、当然尽量早用。19. 固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题 的。20. 固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现在 也要做这个，实验室老师教的。21. 四度放1周应该没问题的，你最好放在-20度，我在 -20度放一个月都还出结果的很多人作的片子很多，不可能 一次作完，一个月没问题.22. 最佳的固定及保存方法：中性缓冲福尔马林（不必调pH）:福尔马林（40%甲醛，用时加入过量碱式 MgC03中和）加 NaCI溶液溶解，定容至 100ml。（2）细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖 玻片，迅速于37C PBS中漂洗2次，

14、每次3-5秒，以清除血 清。将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定 30min。（4）用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒， 晾干保存于-20 C备用。可长期保存，做实验时，取出片子， 入PBS湿润后即可进行你的实验。可以用于做免疫细胞化学.）或免疫荧光。（本帖没有加 分）23. 细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可 以用.24. skywalkerzz wrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸 泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片？爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化 氢导致严重脱片25. 本

15、人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。 保存的时候注意片子最好晾干， 不要挤压，防止粘片和碎裂。26. 细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是 倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在 4度，最长半年没问题。27. 1、用新鲜配制的预冷的 4%多聚甲醛缓冲液室温固 定15 min , PBS mol/l,洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了2、爬片PBS mol/l,洗涤3遍后是否能保存，怎样 保存？1、洗过就可以做免疫组化了。2、 固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之前 再洗。28. 细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。

16、细胞固定后可 室温保存在丙酮中，不使之干燥。29. 如果是检测膜上的物质，好象不能用酒精，30. 适当密度后取出固定（丙酮-20固定1020min），再 进行免疫染色。31. 一批细胞爬片，如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固 定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。如果细胞爬片是在 24孔板或6孔板里进行，冷丙酮 会腐蚀板子，最好 4%多聚甲醛。32. 细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。33. 4%多聚甲醛固定后 PBS水洗，自然干燥后用锡纸包 裹，-20度冻存不超过1月。34. 如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞35. 可以买NUNC

17、公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox™ Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌， 经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪， 使用效果好。上海生工有现货，不用国外定货。我使用后，觉得效 果比玻璃盖玻片效果好很多。36. 我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水（80%，90%，100%，100%酒精各一次，每 次10分钟左右），然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡 切片了，可以保存一定的时间。这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是 可以的。免疫细胞化学染色操作规程一、材料和1、 玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2

18、%多聚赖氨酸包被 处理玻片。2、5-10%正常山羊血清封闭液，用 PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。4、PBS5、1% BSA-PBS （含% Tween20）6、AEC 底物（1）底物缓冲液（ 20X ） PH 醋酸（分子量）Triton -100醋酸钠 3H2O （分子量）克加蒸馏水到 960ml ，调 PH 到，最后加蒸馏水到总体积 1000ml（2）AEC （ 20X ）AEC 15mg/ml ，溶在 DMF （二甲基甲酰胺，分子式 HCOH（CH3）2 分子量中）（3）% H2O2 （20X ）临用时，（1） （2） （3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀 30

19、 分钟内有效。7、DAB （即 DAB-4HCL ）（1）克 DAB 在 100ml 水溶液中（ 20X）（2）1M Tris （20X）,用 HCL 调 PH 至U（ 1 ）（ 2）（ 3）各滴加入 1ml 二蒸水中，新鲜配，避光， 30 分钟内有效。溶解后（可加热到 500C）,加水合氯醛 50克（水合氯醛Chloral Hyclrate ，分子量），枸橼酸 1 克，充分溶解，于棕色 瓶中，室温或 40C 保存8、苏木素复染液苏木素 1 克碘酸钠 克钾矾 50 克水 1000ml9、含 10%及 2% 小牛血清的 DMEM 培养液。10、3%H2O2 ：30% H2O2 1 份，加 9 份

20、双蒸水， 临用时配。11、细胞抗原玻片及 96 孔细胞抗原板（见 ICC protocol 04 ）12、封片液： 1 克明胶，溶于 30ml 350C 水中，加入 35ml 甘油（或用甘油封片）和 650mg 石碳酸（先溶于水中） 。二、 细胞内源过氧化物酶阻断（使用 HRP 标记二抗或 SP 法时必 须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板， 置室温或 370C 10-15 分钟， 使恢复温度。2、力口 3%H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分 覆盖住细胞。3、室温10分钟后，甩掉 H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。 用滤纸吸干细胞周围水份， 96 孔在滤水纸上扣干， 但

21、注意保 持细胞湿润。三、封闭细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分钟后甩掉封闭液， 不洗。四、免疫化学染色1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37C 1小时或4C冰箱过夜；2、 弃去一抗，如为细胞涂片用PBST 轻轻简单淋洗 1 次后， 浸于 100mL 含 PBST 洗杯，漂洗(最好在慢速摇床上) 3-5 分钟，转入第二杯 PBS (1000ml),如上法漂洗3-5分钟。擦 干细胞片周围水分， 96 孔板则倒掉一抗后，每孔加满 PBST 在摇床上摇洗 3-

22、5 分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞 湿润，反复 3-4 次；3、加(法，即放大法)(1)加已优选好的浓度的 Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔， 细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37C温和孵育30分钟；( 2)按免疫化学染色 “2” 所述方法洗涤和擦干；(3) 加已优选好浓度的， 用量同“ (1) ” , 37C 孵育 30 分钟后按免疫化学染色 “2” 法洗涤及擦 干；4、间接法加二抗(不放大法)方法同法， 但不用 Biotin 标记二抗， 而改用 HRP

23、直接标记二 抗。并省略( 3)步骤；5、加底物显色( 1 )、加足量的 AEC 显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，板50ul/孔，置于37C恒温箱孵育5-10分钟，一般 在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到 满意的结果（阳性对照显色程度为 “+” ）， 用自来水即可终止反应；（2）、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加 苏木素复染液 1-2 滴，1 分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲 洗掉苏木素，再浸于 PBS 中约 30 秒钟返蓝色，最后在蒸馏 水中漂洗。6、封片 洗后细胞片擦去周围水分，滴加 1 滴甘油明胶封片液，加 盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。五、结果判 断KSHV 阳性诱导后 BCBL-1 细胞有 10%-30% 显红 色，强度不一，未诱导 BCBL-1 阳性细胞（ 1-30% ） 阴性诱导和未诱导 BCBL-1 细胞完全不显 色（排除边缘效应）MCMV/HVMV 阳性感染病毒的细胞有病灶反 应，显红色，强度不一，未感染细胞不显红色（排除非特异 性染色）阴性感染细胞和未感染细