氨基酸测定精

1、4.1光度分析法B -氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质，其颜色深浅主要与B -氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测 量B-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。 就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。4.1.1试剂的配制:缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc HAc缓冲溶液B -氨基丙酸标准溶液的配制：用电子天平准确称取1.020 g B -氨基丙酸件化纯）,溶于250ml pH=6.00缓冲 溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。茚三酮

2、试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚 三酮水溶液。4.1.2标准曲线的确定分别准确移取 0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、 1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10mi n。冷却到室温，用 7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。4.1.3样品的测定稀释待测液于0.24mg/ml0.73mg/ml,调pH值到6.00，以相同的反应条件， 测其吸光值并与上面的标准曲线

3、对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为B-氨基丙酸的浓度。4.1.4标准曲线的测定结果B -氨基丙酸浓度在0.24mg/ml 0.73mg/ml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表 现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线 如图1:图1标准曲线的测定Fig 1 Determination of the standard curve注：在沸水中加热10min，B -氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、 缓冲溶液pH=6.004.1.5样品的测定分析将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀

4、释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热 10min, 测得如下数据如表3：表3样品的测定Table 3 Determination of sample待测液序号待测液所对应的反应时间吸光度A110h0.320220h0.710322h0.5624.1.6浓度对显色反应的影响：实验表明，B -氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml,随着B -氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于0.73mg/ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。当B -氨基丙酸的浓度在0.24mg/m 0.73mg/ml时

5、，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作 为测定范围。得到的数据如表4:表4 浓度对显色反应的影响Table 4 Concen trati on on the color react ion标准液的浓度(mg/ml)0.140.240.600.730.89颜色变化基本无色浅蓝蓝深蓝蓝紫吸光度A0.0460.4000.7461.2721.120注：在沸水中加热10min，标准溶液的体积为5ml,加入1ml茚三酮水溶液。 4.1.7 pH值对显色反应的影响以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min, 观察到的颜色变化如表5:表5 pH值对显色反应的影

6、响Table 5 The influence of pH on the color reactionpH值3.425.015.165.435.506.007.449.0510.30颜色无色浅蓝浅蓝蓝1蓝蓝1蓝深蓝红棕色红棕色红棕色注：在沸水中加热10min，B -氨基丙酸标准溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、缓冲溶液Ph=6.00显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当 pH值小于3.42时几 乎无色，而在pH值在3.78 7.44时颜色变化明显。pH值为6.00,加热不到二 分钟即显色；pH值为9.05,加入茚三酮溶液后不加热 30s左右即显红棕色；茚 三酮水溶液在强碱的条件下带有明显

7、的淡黄色。因此pH值为6.00左右最好。故我选定pH值为6.00。此时显色明显无干扰且稳定。4.1.8温度和反应时间的影响：实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢 导致显色时间长，而且显色效果不好。而温度过高，反应时间长对此反应影响也 很大，会生成紫色化合物影响其吸光度。在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说，B -氨基丙酸浓度在0.24mg/ml 0.73mg/ml时，在 沸水中加热 10min 即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。时间过长，溶 液挥发严重也影响其吸光度。故我把反应时间定在 10min 左右。4.1.9 其他因素的影响不同

8、溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。 为了区别它们对显色反应 的影响，我做了如下实验：分别称取 0.2002g 茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、 丙酮各100ml中，可以观察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取B-氨基丙酸标准溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值为6.00的NaAc HAc缓冲溶液稀 释到 5ml 再依次加入 1ml 茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加 热。实验表明：在加热 2min 时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水 溶液无色。在加热 6min 时，丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液 的所显颜色最深。乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。基于这一点的考虑，我采用茚三 酮水溶液。 而茚三酮的用量对此显色反应的影响不大， 可以选择 5ml 的被测液与 1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反应。测定时，最好选择标样与待测液在同一水浴