生物论文玉米黑穗病对激酶反应翻译

1、一种玉米激酶与对于黑穗病的抵抗力强弱之间的关系周伟良 晁清 张楠 叶建荣 谭国清 李佰林 邢月先 张博琦 刘海军 Kevin A Fengler 赵静 赵贤荣 陈永生 赖锦盛 严建兵 徐明亮黑穗病是一种典型的由土壤传播的S型黑穗病黑粉菌真菌引起的对全球的玉米产业造成重大威胁的玉米疾病。一种主要对黑穗病有重要抵抗作用的名字为Qhsr1的基因被定位在玉米2号染色体。这里我们报告了QHSR1的图位克隆以及QHSR基因对于疾病抵抗作用的分子机理。以下精确的测量和基因改造互补测定证明了ZmWAK 是QHSR1基因中的关于对于玉米黑穗病有强烈抵抗作用的相关片段。ZmWAK跨越了细胞质膜，潜在的作为一种细胞

2、激酶的受体去感知和传递细胞外的信号。ZmWAK在植物抵御丝孢堆黑粉菌的活体营养的地方表达的十分旺盛。中胚轴损害的表达损害了ZmWAK阻碍抵御机制。ZmWAK基因的删除在被人工繁育并传播的玉米的种胚中表现出影响，并且ZmWAK激酶的作用范围在玉米的进化过程中受到了限制。玉米（Zea mays L.）是世界范围内种植最广泛的一种农作物，并且是一种重要的食物和动物饲料的来源同时也是生物工程和其他工业工程的重要原料来源。当时间推移到2015年时，人类的人口总数预计将达到92亿（数据参见URLs）为了满足如此多的人口的粮食需求，不仅不断改进提高主要农作物的生产潜力是十分必要的，而且不断减少生产过程中的生

3、物和非生物损失也是十分必要的。玉米黑穗病是一种由S型黑粉菌引起的在全球大多数玉米种植区发生的玉米疾病，而且玉米黑穗病在爆发期间会造成巨大的损失1。这种土壤携带的名为S型黑粉菌的病原体会侵入玉米幼苗并且在其中盎然生机地生长至玉米刚刚进入花期，这时，黑粉菌的生命模式转变成高效的形成孢子，这个过程引起在玉米花簇中大规模的芽孢囊群的出现，所以这种玉米疾病被叫做“黑穗病”。S型黑粉菌也可以一起玉米花穗的变叶病以及玉米的生长矮小2。玉米黑穗病导致被感染的植物在生产方面的能力完全丧失，而最为经济和环境友好的降低生产损失的方法就是繁育并充分利用杂种玉米的抵抗力优势。在和其他的谷物农作物，比如大米（Oryza

4、sativa）和小麦（Triticum aestivum）进行比较后发现，玉米在数量上拥有更少的已经被广泛的在种畜行业应用的对于疾病有抵抗作用的基因。玉米中只有三个基因属于那些被应用于种畜业的基因Hm1（赋予玉米对于玉米叶枯病菌1型抵抗力），Rp1-D（赋予玉米对于一直常见锈病，普通锈病的抵抗力）和Rxo1(赋予玉米对于大米的细菌性条纹病的抵抗力)已经得出结论成为能为玉米的一些抵抗力提供相应原因的基因4-6。相反的，玉米在数量上相对来讲具有更多的在土地中可以施展的反击大多数疾病的场所。7 累积渐增的多重性的对于抵抗力方面的微小的影响可以最终产生出对于疾病较高甚至完全的抵抗力。8,9而且，在数量

5、上的抵抗力通常来说比在品质上的抵抗力更加持久有效。10,11 然而，对于赋予植物这种在数量上抵抗力的基因的图位克隆法已经被证明是极其困难的，原因如下：1.较小的基因方面的影响，2.在不同的地理和年份疾病的严重的基因方面的变异，3.疾病的症状在进化过程中的单调均匀性的缺失12-15.迄今为止，只有一种在玉米中名为QTL的基因被确定与玉米中具有对于茎秆炭疽病腐烂病的抵抗力的一种变种的产生有因果关系。16这里我们将作出关于Qhsr1基因图位克隆的报告，并且我们将探究该基因与抵抗力之间联系的分子机制。成果对于Qhsr1基因的精确定位我们事先在玉米的2号染色体长臂上发现了Qhsr1的显性基因，该基因可以

6、降低高达25%的黑穗病发病率。（ref.17）这种基因在各种各样的种群测绘时总是被确定出来。18,19通过同位素标记法辅助选择的方法测定关于黑穗病的易感线可以逐年取得值得注目的降低黑穗病的发病率的效果，这证明了Qhsr1基因对于玉米黑穗病的控制力的巨大潜力。20 为了精确定位qshr1基因，我们制造了Ji1037(具有较高的抵抗力)和Huangzoa4(较为容易被感染)的回交杂种的多代进行对比，并且在qhsr1基因的附近发展出密度较高的分子等级的标记。（参见补充表格1）。通过利用一种源于实验计划21号的重组细胞，我们成功的得到了140个重组细胞，并最终将qshr1基因限定在了标记STS1M3和

7、标记STS3M1之间的一个侧面上（参见补充图片1a-c）。和数量性状基因座分析结果一致的是，qshr1基因在多重回交杂种种系中能够降低18.6%到26.7%的黑穗病发病率。（参见补充图片1d）ZmWAK是候选的关于抵抗力的基因Qhsr1基因中对于STS1M3片段和STS3M1片段的标记可以被用来去显示Mo17基因（和QHSR1基因具有相同的区域）而且被存录在了图书馆里。Qhsr1基因中包含的BAC片段克隆体被安排了顺序并且添加了注释。有趣的是，QHAR1基因的区域在STS1M3标记物的侧面。并且STS3M1片段的长度在玉米生产线上在一定的大体范围内变化。Mo17片段的长度为152kb，然而，H

8、Z4间隔的长度仅仅为5kb。这在147kb上的删除可以用来解释为什么我们无法在玉米的生产线上得到存在在STS1MSHE ，STS3M1的基因片段的这个结果。进一步而言，我们选择了一些关键的重组细胞来形成一个杂交的种系群落。拥有152kb的删除的段落对于疾病的发病率降低了20%，这个结果从而证明了在该区域中，QHRlin 基因的存在。 在Mo17和ZmWAK和ZmHCH和ZmTIF和ZmXa21-land和ZmXa21-2之间qhsr1的一段长度为152kb的基因间隔中有五种有解释作用的基因。我们将来自B73（一种拥有抵抗力的近交系，对于在土地上的5%的疾病来说）一种的相应的基因序列和预测的Mo

9、17基因排列起来，这表明了在B73中ZmXa21-land和ZmXa21-2的完全丢失。然而，基因片段ZmHCHand和ZmTIFhad被宣称在结构上存在不同点而只有ZmWAK是完好无损的。（参见补充图片3）。一种对于RNA的表达的试验证明了ZmWAK在品种名为Ji1037的玉米幼苗的全部组织中表达，然而，ZmHCH和ZmXa21-1仅仅分别在在植物的根部和芽胚鞘中精确的表达。ZmTIF和ZmXa21-2在检测中没有在任何的组织中被检验到。（参见补充图片4）。此外，我们在每一种表达的基因上进行了标记（参见补充图片5）并且在有62个不同的对于疾病既不是有抵抗力也不是易感染的近交系的一个控制板上研

10、究了关于变异基因的存在问题。我们发现ZmWAK和ZmHCH在所有的拥有抵抗力和一些容易感染疾病的品系中都是存在的，然而ZmXa21-1在容易感染疾病的品系和拥有抵抗力的品系中都是随机存在并被我们发现的（参见补充图片5b）。同样的我们发现，这些结果暗示ZmWAK很可能是与qhsr1基因的抵抗力起到决定性作用的基因。 为了证明我们关于ZmWAK基因参与了对于玉米黑穗病抵抗力的形成的假设，我们从一个Mo17 BAC片段上隔离出一个长度为13.1kb的染色体组碎片，其中包括了完好无损的译码以及一段长度为3.92kb的ZmWAK基因的启动子区。通过介绍在玉米杂交品种Hi-II之中的外来ZmWAK基因可以

11、将三种单独的转基因实验联系起来（参见资料2a）。我们将品种T1和品种HZ4（缺少ZmWAK基因）杂交来产生F1品系。转基因的品系F1和品系HZ4之间既不是自交也不是回交来产生F2，BC1F1和BC2F1种系来进行功能性互补的实验。在BC1F1和BC2F1种系（排除实验1-1中的BC1F1种系）中，转基因植物的疾病发病率在和它们同科属的非转基因的植物的对于疾病的抵抗力相对比来说是显著降低的（达到19.2%26.9%，P<0.05）。在F2种系中，转基因植物，既包括纯合子也包括ZmWAK的外生的异形接合体，的发病率降低了26.5%42.8%（参见资料2b）。相对地，由实验17-2和9-21中

12、得到的转基因植物与HZ-4Qhsr1（一种和QTL的近等基因系产生的HZ4）中观测到的产物水平可以比得上，然而，从实验1-1中得到的转基因植物表现出了异乎寻常的低表达水平（参见资料2c）。此外，我们用一个ZmWAK的RNA的介入改变了Hi-II基因的结构，并且转基因T1植物经过和Ji1037品系杂交两次来产生BC1F1品系。所有的来自五个独立实验的转基因BC1F1品系在和非转基因T1品系相比较时表现出对于玉米黑穗病抵抗力的降低，虽然只有实验2-119中表现出了非常明显的抵抗力降低（P<0.05,参见资料2e）。抵抗力降低的现象使我们联想到了在植物体内ZmWAK的对应RNA表达量的极低的表

13、达水平（参见资料2f）。除了1-21号实验体，其它的的转基因植物相对于Ji1037来说，表现出了对于ZmWAK基因的表达能力的增强，并且这种现象可能与杂种优势有关。全部的这些结果表明Qhsr1基因中的ZmWAK片段是植物对于黑穗病的抵抗力的来源。ZmWAK的特性我们通过隔离从Ji1037品系中获得的RNA来完整的获取了ZmWAK基因的序列抄本。ZmWAK基因编码了一种与联合激酶家族有关系的一种拥有独特作用范围蛋白质受体，这个激酶家族中包括了细胞质中的丝氨酸和苏氨酸的激酶，皮肤表面的钙调节蛋白生长因子激酶以及细胞外的半乳醛聚糖粘合剂激酶（参见图片1dand和资料图6a）。WAKs组成了一个参与了

14、植物生命中许多方面过程的蛋白质的大家族。在鼠耳芥和拟南芥中，WAK类似蛋白通过多种标志性的途径参与了植物的生活，包括了植物对于疾病的抵抗力，植物对于重金属以及铝的耐受力以及植物的生长。在谷物粮食中，基因WAK族通过在进化中发展出拥有不同的组织特异性的种类来进行扩张，并逐渐的控制了外部分泌物的产生，引起了表达的模式。玉米中有大于100的注释WAK基因分布在多重的染色体上。在精氨酸（转）存在的情况下，精氨酸在具有催化作用的冬氨酸盐的相邻位置，这时WAK基因可以被分类于第三激酶和非第三激酶中。不像它的来自鼠耳芥的同源基因（编码第三激酶）的是，ZmWAK基因编码了一种非第三激酶（参见资料图片6a）。大

15、多数的辨别保护性微生物或者病原体分子的模式辨别受体都是非大三激酶。在系统发生的分析中，在玉米中由ZmWAK基因编码的第三激酶和非第三激酶具有在所有的三个领域中的完全的版本（GUB,EGF-CA和激酶），并且趋向于在不同的枝系中的分离的丛组，这暗示了他们的在功能上的不同（参见资料图片6b）。我们检验了在洋葱表皮细胞中和玉米原生质体中融合了加强的绿色荧光蛋白后ZmWAK基因进行的短暂的表达情况。我们发现ZmWAK基因在质壁分离的前后会使原生质薄膜局部化，与它们作为细胞外的接收器的预测作用有关。我们也检验了在Ji1037秧苗和成年植株（在抽穗之前）的不同的组织中基础的ZmWAK基因的表达情况，我们发

16、现在不同的组织中表达的程度不同。例如在幼苗中，ZmWAK基因的表达产物在中胚轴中比在叶子或者根部中高了大约10个单位，然而在成年植株中，ZmWAK基因主要在地面上方的第一个节间和顶部的叶子中表达（参见资料图片3f）。此外，在胚芽鞘中ZmWAK基因的表达在植物面临混合米丝轴黑粉菌孢子虫的近亲混合交配的挑战的12小时后开始被引起而表达。在鼠耳芥中，AtWAK1感受器可以察觉到一种植物细胞壁的退化的名为寡聚半乳糖醛酸的产物，并且AtWAK2基因被发现与细胞胶质以及细胞组织的膨胀的现象有关。在已知ZmWAK基因与AtWAK基因的序列的相似性很高的条件下，我们假设ZmWAK基因在渗透压的调节中具有相似的

17、作用。于是我们构建了一种有关于细胞质领域的激酶以及对于鼠耳芥油菜素内酯不敏感的外功能区的嵌合感受器。（BRI1）(参见图片3h)。我们介绍玉米原生质体内的结构来确定是否嵌合的感受器能够感觉到细胞外的不拉西诺内酯的对于细胞内的WAK激酶的含量的下降，并且调节恢复正常状态。用布拉西诺内酯处理会造成由不带菌的细胞转化而来的细胞高达81.5%的几率死亡，这个结果与没有转化的细胞相比没有什么明显的区别（89.7%的死亡率）。通过对比，在具有嵌合BRI-ZmWAK结构的细胞在布拉西诺内酯处理后有明显的死亡率的下降现象（41.7%）。当细胞表达BRI-ZmWAK Lys44Ala（一种三磷酸腺苷结合的位点发

18、生突变的个体）或者BRI-ZmWAK Ser640Ala基因（一种预测的在磷酸化的位置发生突变的个体）（参见图片3h）的时候，玉米原生质体的对于渗透压的自我保护能力与表达了BRI-ZmWAK基因个体相比有着明显的减弱，正如转基因和非转基因玉米在实验中的死亡细胞的百分比大大接近的现象所表明的那样（参见图片3j.）这些发现表明ZmWAK基因对于细胞外的信号传感器的作用依赖于它对应激酶的活性，同时这个现象也暗示了ZmWAK基因参与到了玉米对于细胞组织膨胀的修复过程中，虽然这种作用如何在玉米对于疾病的抵抗力中发挥的作用目前仍然是不清楚的。ZmWAK基因在玉米中胚轴中对于玉米丝黑穗病菌的抵抗力玉米丝黑穗

19、病菌的冬孢子在土壤中度过冬天，在种子处于紧急情况的时候由玉米的根部侵入种子中。该疾病在玉米抽穗时在穗上的发病的发展进程很大程度上取决于该真菌是否能够抵达玉米幼苗的分裂组织。玉米的中胚轴连接着胚芽鞘的基部和种子，因此，玉米丝黑穗病菌需要穿过胚芽鞘来渗入玉米根尖的分裂组织进行成功的感染。考虑到ZmWAK基因在玉米的中胚轴中大量表达，我们推测中胚轴也许就是玉米抵抗玉米黑穗病病菌入侵的主要区域。为了确定这种可能性，我们仔细的研究了来自玉米种子，包括胚芽鞘、中胚轴上部分和中胚轴下部分的三个横向切片。在种子播种三天后，胚芽鞘从土壤表面浮现出来，并且中胚轴的延长已经停止。玉米丝黑穗病菌在HZ4植株中表现出了

20、一种分配的浓度梯度变化曲线，玉米丝黑穗病菌在下方中胚轴中表现了较高的丰度，而在胚芽鞘中则表现出了较低的丰度。在于亲本的曲线进行对比的过程中，近等基因系的HZ4-qHSR1关于玉米丝黑穗病菌在中胚轴的上部和下部以及胚芽鞘中不可发觉的真菌的菌丝的表达的数量情况具有类似的情况。在播种7天后，玉米丝黑穗病菌的数量在所有的HZ4植株的种子的三个部分的增加情况都有了戏剧性的增加，然而HZ4-qHSR1植株在中胚轴下部表现出了相似的玉米丝黑穗病菌的高浓度表达但是在中胚轴上部却有着明显的下降（仅仅占HZ4植株表达量的4%左右）并且在胚芽鞘中仅仅有微小的可发觉的数量（参见图片4c）。在3天的时候，ZmWAK基因

21、的表达物在HZ4-qHSR1植株中也表现出了浓度梯度曲线，与胚芽鞘中的浓度相对比，中胚轴中的浓度非常高（参见图片4d）。然而，ZmWAK基因的表达在7天时在所有部分都是下降的，尤其是在中胚轴的下部（参见图片4e）。当第三天和第七天中胚轴中ZmWAK基因的表达相对于没有经过预防注射的植株相比增加的时候，ZmWAK基因对于玉米丝黑穗病菌十分敏感。我们同样也检测了水杨酸和茉莉酮酸酯应答基因的表达情况。在HZ4-qHSR1中水杨酸应答基因的基础表达等级比得上那些在HZ4植株中的ZmPR5基因的表达情况或者在第三天的时候明显低于那些在HZ4植株和ZmPR-lat3植株（P<0.05）中的数量）。然

22、而，在第七天的时候，在HZ4-qHSR1植株中所有的三个部分的表达等级比在HZ4中的高。当我们用玉米丝黑穗病菌来检验玉米种子的时候，HZ4-qHSR和HZ4植株中的ZmPR-land ZmPR51产物的表达含量有所提高。此外，在第七天的时候HZ4-qHSR1对于ZmPR-land和ZmPR5的表达产物分别较HZ4植株有了2.6-和2.3-个凹处的表达含量的提高。通过对比，ZmNPR1基因的表达仅仅在第三天的HZ4-Qhzr1植株和第七天的HZ4植株被引起（参见图片4f）。通过与水杨酸应答基因的对比，茉莉酮酸酯应答基因也是仅仅在第三天和第七天的HZ4植株和HZ4-qHSR1植株中表达，但是对于这

23、两种曲线呈现出略微的不同（参见图片4g）。在HZ4植株和HZ4-qHSR1植株中茉莉酮酸酯应答基因的表达的降低现象也许与玉米丝黑穗病菌的引起疾病的活动有关，正像关于玉米丝黑穗病菌的相关报道中说的那样。在中胚轴中，玉米丝黑穗病菌基本上扩散并积累与韧皮部中(参见图片4h)。有趣的是，ZmWAK基因在韧皮部通过RNA的原位杂化的表达基本上是无法发现的。通过对比发现，ZmWAK基因在木质部的软组织细胞和包围着韧皮部的中柱鞘软组织细胞中有着较高的表达（参见图片4i,4j）。一并考虑上述现象，这些结果暗示了ZmWAK基因也许监视着玉米丝黑穗病菌的活动来引起玉米的天生的免疫力来抑制玉米丝黑穗病菌的活体营养的

24、孢子成长并进入空气中，进而降低了疾病的发生率。受损的ZmWAK基因会损害玉米的抵抗力通过基因标记选择将基因渗入Ji1037品系中的Qhsr1基因的区域后，该植株对于玉米黑穗病的抵抗力有了明显的提高。我们研究了在十个易受感染的植株的ZmWAK基因处施加罂粟碱的实验并且发现它们中的五个（8902、8903、982、V022和V4）中含有ZmWAK基因。为了研究对于所有的抵抗力的具有影响的变异是序列等级上的敏感变异还是一种表达过程中的不同，我们在较高的易感品系8902, 982, V022 和V4，以及拥有适度的抵抗力的B73品系和具有较强抵抗力的Zheng58品系中将ZmWAK基因进行了人为的排序

25、。通过将ZmWAK编码产生的蛋白质与Ji1037产生的蛋白质的氨基酸序列进行对比，我们发现了八个氨基酸发生改变的位点，其中有7个氨基酸发生的替换的位点以及1个氨基酸的缺失的位点（参见图片7a.b）。然而，蛋白质变异影响分析设备（PROVEAN）预测出没有氨基酸的替换或者氨基酸的缺失对于ZmWAK基因的作用没有产生任何损害（参见图片7c）。通过对比，我们发现ZmWAK基因的表达在不同品系的中胚轴的曲线中有着重要的区别（P<0.05），但是对于植物的根部或者叶子中没有这种现象（参见图片7d.）。这些结果表明一些品系玉米的易感性首要与他们在中胚轴中相对较低的ZmWAK基因的表达有关而不是和他们

26、的编码蛋白的变异有关。ZmWAK基因进化的方面同其他的农作物相比，玉米具有相对较高的基因多样性，除了SNPs之外，基因复制时的变异以及PAV情况普遍并广泛的分布在玉米的染色体组中，另外这些结构的变异被认为与玉米多样的特性有关。在Qhsr 1基因的区域里，易感病的HZ4植株有着一段147kb的缺失，同时在该区域也有着一段包括62中不同的近亲繁殖的品系的嵌入基因片段（参见图片5b）。于是，我们在包括522个近亲繁殖的玉米品系以及184个墨西哥类蜀黍（Zeaspp）的范围内开展调查来检验ZmWAK基因源头和分布。ZmWAK基因的缺失仅仅表现在玉米的种质中，但是在我们进行检验的墨西哥类蜀黍中没有这种现

27、象（参见资料表格2）。这个发现表明ZmWAK基因的缺失也许会在玉米从野生的蜀黍驯化时候发生的。而且，我们发现缺失ZmWAK基因的玉米近亲繁殖品系往往是来自同一个亲本。例如，十种中国顶尖的缺失ZmWAK基因的近亲繁殖品系都有着HZ4品系的基因背景（参见表格3）。这表明ZmWAK基因基因的缺失并不会对于农业的表现造成不利的影响，并且这种形状在玉米的品系中保持了下来。要不然，正如在RPM1实验中表现的那样，这种ZmWAK基因的趋势可以在玉米种质中保持并传播，即使当疾病造成的压力表现出来的时候。我们接下来通过23中墨西哥蜀黍和54个玉米品系对于ZmWAK基因的启动子和转录区域进行了测序定位，这样我们鉴

28、定出61种单倍体，Mo17单倍体有着最大的比例（参见表格2）。这里没有证据证明在测序的区域中有着某种选择性的延伸，除了外显子3之外，在这个外显子中核苷酸的比率（0.17）在玉米中与在其他的ZmWAK基因的区域中的比率（0.37-1.32）相比大体上较低（参见图片8）。外显子3编码相关范围的激酶，所以可能与作用的限制情况有关。有趣的是，当我们排列玉米的ZmWAK基因的启动子序列的时候，我们发现在462bp的位置有一个与起始密码子有关的变异片段的插入。对于序列的分析（基于基因信息组织的调查成果）证明这些来自可换位的要素的插入的组织序列（参见图片9）暗示一旦在ZmWAK基因的启动子的位置发生了插入情

29、况，那么普遍性的可换位的要素的插入活动也将经常发生，这种现象也许与不同的ZmWAK基因的家族成员的不同功能的形成有关。结论玉米丝黑穗病菌的冬孢子在玉米种子遇到危机的时候侵入并且迅速的繁殖来进入初生的花的相关组织中，在那里引起玉米黑穗病。在本次研究中，我们克隆了与玉米对于玉米黑穗病强大抵抗力有关的ZmWAK基因。有趣的是，ZmWAK的相关的抵抗力主要发生在玉米种质的中胚轴之中，而不是我们想象中的发生在玉米的黑穗病典型特征出现的抽穗部位。这种抵抗的方式表明ZmWAK基因已经进化出一种在时间上的最优化的抵抗策略来对抗玉米丝黑穗病菌。随着它成功地入侵玉米的种质，玉米丝黑穗病菌的活体菌丝侵入了中胚轴的韧

30、皮部之中并且向上侵入到玉米茎尖的分生组织中。同时，ZmWAK基因存在于xylem软组织和中柱鞘软组织细胞之中，作为感受器类似物的激酶而存在，也许是或直接感受到玉米丝黑穗病菌制造的标志性产物然后触发对于疾病的强烈反应。与和抵抗力相关的ZmWAK基因相比，alleles与表达的等级有着关系，尤其是在玉米的中胚轴中而不是其他种子的组织中。简单的说，ZmWAK基因抵抗力在合适的时间与合适的地点进行反应来实现对于疾病控制的最有效的作用。然而，我们无法控制这种其他的组织也许与这种表达有关的影响。玉米丝黑穗病菌有着漫长的生物学的生命周期，需要在玉米的穗中进行转移来引起疾病。有着玉米丝黑穗病菌的存在，这种植株

31、可以成为一种杰出的模型来研究主观的基因引发的抵抗力与生物学的在植物生命周期中的抵抗力的不同。PAV在玉米中是普遍存在的，至少一次PAV事件与玉米的对于疾病的抵抗力是有关系的。ZmWAK基因的彻底的缺失削减了ZmWAK基因的表达并且导致玉米对于黑穗病的易感性。另外，ZmWAK基因在易感性与抵抗力属性之间突变的多样性也许对于玉米黑穗病主要感染并且在玉米的中胚轴中被发现有着某种关联。在HZ4植株中ZmWAK基因的缺失没有导致任何农业产量上的影响，表明ZmWAK基因的缺失是可以忍耐的并且随着遗传的曲线而传播。最终，这种ZmWAK基因的特质不仅仅对于易感性的抵抗力的克隆产生影响，同时对于更深入的控制玉米

32、黑穗病的研究提供了前提。引用：1.National Maize Improvement Centre of China, China Agricultural University, Beijing, Peoples Republic of China.2.Maize Research Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling, Peoples Republic of China.3DuPont Agricultural Biotechnology, Wilmington, Delaware, USA.4.Na

33、tional Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Peoples Republic of China. 5.These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to M.X. (mxu).Received 18 June; accepted 1 December; published online 22 December 2014; doi:10.1

34、038/ng.3170Figure 1 Fine mapping of the resistance QTL qHSR1. (a,b) Head smut symptoms in the tassel (a) and ear (b). (c) Sequential fine mapping of qHSR1. The vertical lines represent the sites of key molecular markers, and the two green vertical lines indicate the flanking markers STS1M3 and STS3M

35、1 in the final mapping step. The HZ4 and Mo17 BAC contigs are represented by overlapping unfilled rectangles, and the predicted genes ZmWAK, ZmTIF, ZmHCH, ZmXa21-1and ZmXa21-2are depicted by colored arrows. (d) Gene structure of ZmWAK. Gray boxes represent the 3and 5UTRs, and the positions of the co

36、ding regions for the GUB, EGF_CA and kinase domains are indicated.Figure 2 Transgenic validation of ZmWAK. (a) Structure of pCAMBIA1300-ZmWAK used for the complementation assay. The construct contains the entire ZmWAKgene and the 3.9-kb promoter region. LB, left border; RB, right border. (b) The res

37、istance performance of pCAMBIA1300-ZmWAKtransformed transgenic plants. The sample size of each group is indicated in parentheses.(c) The relative expression levels of ZmWAKin the mesocotyl of F2progeny from three complementary transgenic events. The data were normalized to the sample of HZ4-qHSR1. E

38、xpression values are means ±s.d. Each sample contained five individuals. There was no expression in non-transgenic plants.(d) Schematic of the RNAi construct pGreen-WAK. Nos ter, Nos terminator. (e) Resistance performance of ZmWAKRNAi transgenic plants. The sample size of each group is indicate

39、d in parentheses. (f) The relative expression levels of ZmWAKin mesocotyl for five RNAi transgenic events. Data were normalized to the sample of Ji1037. Expression values are means ±s.d. Each sample contained five individuals. A 2test of independence or a Fishers exact test indicated a signific

40、ant difference. *P< 0.01, *P< 0.05; NS, not significant. Figure 3 Subcellular localization and expression pattern of ZmWAK. (ae) Confocal scanning (GFP; left), differential interference contrast (DIC; middle) and merged (right) micrographs of onion epidermal cells transformed with the pEZS-NL

41、vector (a) or the 35SøWAK-EGFPconstruct and left untreated(b) or subjected to plasmolysis (c). Scale bars, 50 µm. (d,e) Maize protoplasts transformed with the pEZS-NL vector (d) or the 35SøWAK-EGFPconstruct (e). Scale bars, 5 µm.(f) Expression of ZmWAKin different tissues of Ji10

42、37 plants. Values are the means ±s.d. of three independent experiments with five individuals per sample. Data were normalized to the tassel sample. (g) Expression of ZmWAKin Ji1037 after inoculation with S. reilianum. Data were normalized to the mock-inoculation sample at 0 hours post-inoculati

43、on (h.p.i.). Values are the mean ±s.d. from three biological replications with ten individuals per sample. (h) Schematic of the expression constructs for the chimeric receptor (BRI-ZmWAK) and chimeric receptor with a mutated kinase domain (BRI-ZmWAKm). Gray rectangles indicate the ectodomain of

44、 BRI1, and blue rectangles indicate the cytoplasmic domain of ZmWAK. The coding sequence for the chimeric receptor was expressed under the 35Spromoter and fused with the coding sequence for an EGFP tag to detect transformed cells. The mutated amino acids are shown. TM, transmembrane region; OCS, oct

45、opine synthase terminator. (i) Micrographs of intact and dead cells in the empty vector and chimeric receptortransformed and nontransformed (red auto-fluorescence) groups. Scale bars, 50 µm. (j) Death rates of protoplasts expressing empty vector, BRI-ZmWAK, BRIZmWAK K444A or BRIZmWAK S640A afte

46、r brassinolide treatment. T, transformed; NT, non-transformed. Values are the mean ±s.d. of two independent experiments. The sample sizes of each group are indicated in parentheses.npg © 2015Figure 4 ZmWAK functions in mesocotyl to inhibit the upward growth of S. reilianum. (a) Maize seedl

47、ings at 3 (left) and 7 (right) DAS, with numbered arrowheads indicating the borders of the different sections: 1, coleoptilar tip; 2, coleoptilar node; 3, midpoint of the mesocotyl; 4, joint between the mesocotyl and seed. These borders delineated the three transverse sections sampled: the whole col

48、eoptile (C), the upper half of the mesocotyl (M1) and the lower half of the mesocotyl (M2). Scale bar, 3 cm.(b,c) Quantification of S. reilianumin the three sections by quantitative PCR (qPCR) at 3 (b) and 7 (c) DAS. Data were normalized to the sample of HZ4-qHSR1coleoptile at 7 DAS. (d,e) The expre

49、ssion patterns of ZmWAKin the three sections of HZ4-qHSR1at 3 (d) and 7 (e) DAS. Data were normalized to the sample of mock-inoculated HZ4-qHSR1at 3 DAS. (f,g) Expression of the salicylic acidresponsive resistance genes ZmNPR1, ZmPR-1and ZmPR5(f) and the jasmonate-responsive genes ZmAOC, ZmAOSand Zm

50、LOX1(g) in the lower mesocotyl of HZ4 and HZ4-qHSR1seedlings after S. reilianuminoculation. Data were normalized to the sample of mockinoculated HZ4 at 3 DAS. Each value in bgrepresents the mean ±s.d. from three biological replications; each sample was collected from at least ten individuals. (

51、h) Massive dot signals of S. reilianumin the transverse section of mesocotyl at 7 DAS visualized with wheat germ agglutinin (WGA)Alexa Fluor 488. Scale bar, 100 µm. (i,j) ZmWAKRNA in situhybridization in 8-µm transverse sections from the mesocotyl of HZ4-qHSR1plants at 7 DAS: hybridization

52、 signals with the antisense (i) and sense (j) probe. Scale bars, 20 µm (i) and 50 µm (j). VC, vascular cylinder; XP, xylem parenchyma; PP, pericycle parenchyma; P, phloem. The red circle indicates the phloem. The dashed rectangle was annotated at the top right. Npg1. Wang, Z. et al. Resear

53、ch advance on head smut disease in maize. J. Maize Sci.10, 6164 (2002).2. Ghareeb, H., Becker, A., Iven, T., Feussner, I. & Schirawski, J. Sporisorium reilianum infection changes inflorescence and branching architectures of maize. Plant Physiol. 156, 20372052 (2011).3. Balint-Kurti, P.J. & J

54、ohal, G.S. in Handbook of Maize: Its Biology (eds. Bennetzen, H.L. & Hake, S.C.) 229250 (Springer, 2009).4. Johal, G.S. & Briggs, S.P. Reductase activity encoded by the HM1disease resistance gene in maize. Science 258, 985987 (1992).5. Collins, N. et al. Molecular characterization of the mai

55、ze Rp1-D rust resistance haplotype and its mutants. Plant Cell 11, 13651376 (1999).6. Zhao, B. et al. A maize resistance gene functions against bacterial streak disease in rice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1538315388 (2005)7. Wisser, R.J., Balint-Kurti, P.J. & Nelson, R.J. The genetic archit

56、ecture of disease resistance in maize: a synthesis of published studies. Phytopathology 96, 120129 (2006).8. Richardson, K.L., Vales, M.I., Kling, J.G., Mundt, C.C. & Hayes, P.M. Pyramiding and dissecting disease resistance QTL to barley stripe rust. Theor. Appl. Genet.113, 485495(2006).9. Mieda

57、ner, T. et al. Stacking quantitative trait loci (QTL) for Fusarium head blight resistance from non-adapted sources in an European elite spring wheat background and assessing their effects on deoxynivalenol (DON) content and disease severity. Theor. Appl. Genet.112, 562569 (2006).10. Parlevliet, J.E.

58、 Durability of resistance against fungal, bacterial and viral pathogens; present situation. Euphytica 124, 147156 (2002).11. Krattinger, S.G. et al. A putative ABC transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens in wheat. Science 323, 13601363 (2009).12. Flint, J. & Mott, R.

59、Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls. Nat. Rev. Genet. 2, 437445 (2001).13. Remington, D.L., Ungerer, M.C. & Purugganan, M.D. Map-based cloning of quantitative trait loci: progress and prospects. Genet. Res. 78, 213218 (2001).14. Yano, M. Genetic and molecular dissection of naturally occurring variation. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 130135 (2001).15. Holland