微生物制药实验总结

1、微生物制药实验微生物制药工程实验总结淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定2014级制药工程1班 刘天雄学号：222014329052043实验背景：淀粉酶是可以将淀粉分子水解成糊精和其它由葡萄糖组成的更小的聚合物的一类酶。一淀粉酶家族由一些具有特异性的酶成员组成,这些酶特异性地作用于由葡萄糖残基通过小糖昔键连接的底物。淀粉酶构成了一类工业酶,这类酶大约占有酶市场的份额。工业上对一淀粉酶的要求是能够在高温条件下获得经济产物,因此对更喜温和耐高温的一淀粉酶非常需要。随着一些耐高温酶的使用,一些工业加工过程能够进行。摘要：土壤中富含各种各样的菌种，而我们主要分离的是其中产淀粉酶的菌类物质并对其进行纯化培养

2、，诱变育种。我们从北碚缙云山中采集一些土壤样本，在实验室中进行淀粉酶产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在合适的培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力，使用分光光度法测定酶的活性，并对获得的淀粉酶产生菌进行诱变育种，观察诱变后的情况。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；诱变育种一、实验目的1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选纯化方法；3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法；4、学习诱变育种的原理，了解淀粉酶产生菌的突变株的活性。二、实验原理土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适

3、宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小(根据公式计算菌株水解淀粉能力，从而定量比较菌株水解淀粉能力的大小,其中D为透明圈直径（mm）,d为菌落直径（mm）, 水解能力计算公式中的直径采用平均直径。来初步判断菌种产淀粉的能力。淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括淀粉酶和-淀粉酶等，-淀粉

4、酶可从淀粉分子内部切断淀粉的-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，根据这个光学特性可用分光光度计测定淀粉溶液的标准曲线，同时测定660nm处样品溶液的吸光度，根据公式,求得样品溶液中剩余淀粉的浓度，可以求得筛选菌种消耗点分的速率来衡量其酶活性。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂1材料：选取北碚区缙云山土质地表层以下510 cm的

5、土壤作为试验样品2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7，121灭菌15min，待冷却至50左右时，于超净工作台倒平板） （2） 筛选培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，可溶性淀粉2g，15g琼脂粉，pH调至7，121灭菌15min，待冷却至50左右时，于超净工作台倒平板）（3） 摇瓶培养：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.0

6、1g, 水 1000毫升，调整pH值到7） （4）斜面培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7，121灭菌15min，待冷却至50左右时，于超净工作台倒斜面）3、试剂： 卢哥氏碘液（碘,碘化钾,蒸馏水300ml；先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘溶解在碘化钾容易中,待碘溶解后,加足水分）、磷酸缓冲液、2%可溶性淀粉、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、250ml锥形瓶、150ml三角瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计、离心机、接种环、涂布棒、试管、离

7、心管、移液枪、移液管、酒精灯、恒温培养箱。四、实验步骤1、筛选培养基的配置配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，并加入80%乳酸数滴，以抑制细菌生长，将灭菌后的培养基冷凝至5560,放在超净台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，以铺满皿底为度。2、淀粉酶产生菌的筛选 （1）初筛：采集土样，称取5g土样， 倒入含1520个已灭菌小玻璃珠的150ml三角瓶中，加入99mL无菌生理盐水， 震荡5-10min使土壤样品充分打散，即得110-2 土壤稀释液，静置5min， 用1mL无菌注射器吸取110-2 土壤稀释

8、液1ml移入装有9mL无菌生理盐水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即得110-3土壤稀释液， 以此类推， 最后稀释获得110-5土壤稀释液备用。将制好的菌悬液稀释为10-3 、10-4、10-5的土壤稀释液与超净工作台上涂布到营养培养基平板上，于30摄氏度培养箱中培养24h，观察哪个浓度下的菌群数量适中以及菌群生长情况。选取菌群生长情况良好的浓度菌液，取100 L上清液加入筛选淀粉培养基平板上均匀涂布，37 倒置培养24 h，长出菌落后滴加稀碘液，挑取有明显透明圈的菌落，经划线分离得到纯种，接种于斜面培养基进行保存培养。筛选流程如图所示。（2） 复筛：从斜面培养基中取初筛后获得菌种，将其接

9、种于淀粉培养基中，继续放在30摄氏度培养箱中培养2-3天，将所得所有菌落分别保存至另外洁净培养基内； 将卢哥式碘液滴在每个平板上，观察是否产生透明圈，选取透明圈最大的菌落保存于斜面培养基上。将复筛菌株接种至LB培养基中，装液量为100ml/250ml,37，设定转速为150r/min，摇床培养15h，高速离心30min，取上清液为发酵提取液。 2、酶活力测定：（1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。（2）酶液稀释：取发酵液进行4000r/min离心5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。 （3）标准曲线制作：

10、准备七支试管，按照下表配置混合液。使用分光光度计测规定各管溶液在660nm下的OD值。然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。 （4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。（5） 酶活力测定：酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。3.培养基的优化单因素变量优化法（方法一）（1）培养基的优化培养基加水量的确定：保持其他条件相同，加水量分别为7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、15ml、17ml,然后每个培养基在37条件下恒

11、温培养72h测定-淀粉酶的酶活变化。培养基中碳氮比的确定：在加水量为10ml、MgSO4添加量为0.1%的条件下，改变培养基的碳氮比，可溶性淀粉与硝酸钾的比例为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6，然后每个培养基在37条件下恒温培养72h测定-淀粉酶的酶活变化。培养基中MgSO4的确定：在加水量为10ml、碳氮比8：2条件下，向各个培养基中分别加入0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25% MgSO4，然后每个培养基在37条件下恒温培养72h测定-淀粉酶的酶活变化。（2）培养基的进一步优化在单因素实验的基础上，为进一步确定培养基的组成，以单因素实验的三个因素为实验因子，以

12、酶活力为响应值进行响应面设计，并对实验数据进行分析，从而确定培养基的最佳组成。正交试验优化法（方法二）正交试验因素水平表试验号因素A加水量/mlB硫酸镁添加量/%C碳氮比D培养温度/170.18:2232100.25:5303130.32:837正交试验结果试验号ABCD酶活力111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3R每个培养基在给定条件下恒温培养72h测定-淀粉酶的酶活变化。筛选出各因素的最优水平组合即得到最优培养条件，完成培养基的优化。4.菌落的形态特征将菌株分别接种于营养琼脂平板和普通肉汤上,35培养48h,观察单个菌落的形状

13、、大小、边缘、表面、颜色、隆起度及透明度等形态特征。4.3菌株的数量检测为更好地判断单菌株产酶及酶活性的测定，需要进行单位菌株数量的检测。摇瓶培养筛选获得后菌株，取培养液1ml，定容至100ml获得浓度为原母液110-2倍的菌液，取10-2倍菌液1ml制得10-4倍菌液，按照相同操作制得10-6倍,10-8倍菌液；分别取100ul四种梯度浓度的菌液均匀涂布于培养基平板上，显微镜观察平板上的菌的数量。选取数量适中的浓度平板，重复多次平行实验。得到多次观察的菌的数量，取平均值，并按照稀释倍数计算原培养瓶中母液的菌株浓度，求出单位菌株数量。5.紫外线诱变育种（1） 紫外线诱变A.取全部培养液于10m

14、L离心管中，以3000 r/min离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。加入无菌水9 mL，振荡均匀；B. 取0.1mL培养液，0.9mL无菌水于1mL离心管中，振荡摇匀，依次稀释。取的菌液进行计数，选择浓度为25万个的菌液作为菌悬液，按照此浓度准备10 mL；C.打开紫外线照射装置，预热30min；D.以磷酸缓冲液作适当稀释后取50ul均匀涂布于5-10个培养基平板中，37恒温培养2d，置于强紫外线（30w）照射环境中5min，取出平板，观察菌落的存活率；按照上述操作重复实验，并调整紫外线照射时间，至菌株存活率为5%-10%时，停止实验；E.挑取

15、存活的菌株接种于新的淀粉培养基平板，37恒温培养24h，滴加卢哥式碘液观察其产生酶活性。（2）筛选标准A.采用淀粉平板观察,计算透明圈直径/菌落直径的比值的方法进行粗筛,挑选比值大的单菌落,接入种子培养基中,在150r/min,37条件下培养36h,取5ml种子液接种于产酶固体培养基,37条件下培养3d后测定酶活力。B.与出发菌株相比,相对酶活小于90%的定义为负变菌株，相对酶活大于110%为正变菌株，而相对酶活在90%至110%之间为非变异株或实验误差。6.实验结果及分析6.1初筛我们将接种稀释浓度为10-3,10-4,10-5三种浓度的土壤混悬液接种于分离培养基平板上；于37摄氏度培养箱中

16、培养24h后观察平板上长满圆形白色菌落，其中以10-3浓度平板中最多依次是10-4,10-5，同时存在部分白色菌落圈周围有一层棕褐色轮廓。6.2复筛 为了辨别那种菌落是符合我们要求的菌落，我们将初筛得到的生长状况良好且益于分离的两种菌接种至复筛培养基平板进行复筛，37度培养24h，得到结果滴加碘液观察是否有透明圈的产生。选取2号图样浓度110-3为的平板进行淀粉透明圈的初筛。分别滴加碘液观察现象。可看到白色菌落周围有明显的透明圈，最大为d=8mm，而在棕色菌落上无透明圈。因此可推断白色菌落产生淀粉酶，棕色菌落不产淀粉酶。白色菌落是我们需要的。6.3菌种数量检测通过在初筛复筛中菌落的生长情况，其

17、中10-5浓度下的菌落生长数量益于观察，经计算得出本次取样的菌种浓度为每克土壤含有2106至3106个菌种。6.4保种培养将复筛得到的菌种做平板划线分离，结果如图。我们将复筛获得生长状况良好的菌种接种至已配好的斜面培养基中，30摄氏度恒温培养24小时，然后放入4摄氏度冰箱中作为保存并放大培养，以备用。一周后，观察培养基未被污染，保存状况良好。6.5摇瓶培养取出保存的斜面培养基，使用接种环挑取菌种到配置好液体培养基的6个编号三角瓶中，37度摇瓶培养48小时后，取出三角瓶。三角瓶内液体培养基成白色浑浊状，底部有部分未溶解的淀粉块。6.6DNS比色法结果还原糖（Glu）标准曲线数据还原糖浓度%00.

18、10.20.30.40.50.6吸光度00.1960.4230.5940.8150.9241.251摇瓶样品编号123456吸光度0.0530.0420.0400.0400.0380.040通过对比可以得出，一号摇瓶中的菌种酶活性最高，酶活为520U。6.7诱变处理我们选取一号摇瓶的培养液未稀释涂布于培养基平板中，未敞开盖子于紫外灯下照射，37度培养36h，得到平板布满菌落，未能成功进行诱变处理。结果如图。于是继续挑取培养基中的菌落划线做第二次诱变处理，使用一次性平板于紫外线下分别照射1,3,5,10,15min和空白对照，37摄氏度36小时恒温培养，结果如图。通过结果可以发现，在10min之

19、内紫外线照射区与遮光区无明显差别，说明10min内紫外照射诱变对菌落生长无明显影响。而10min与15min两个分区都出现了明显的生长状况的差异。而在透明圈检测中，却并没有发现不同分区以及不同时间照射情况下的菌落透明圈有明显差别。6.8 误差分析菌株的筛选本实验通过选择性淀粉培养基对土壤中产淀粉酶菌进行初步筛选，又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到纯培养。对比其他筛选方案，如先获得纯培养，再筛选产淀粉酶的菌株等，本实验方案的实行效率更高，操作也较为简单。紫外诱变在实验过程中，由于缺乏经验，操作不熟练，通常导致实验结果不稳定，甚至是错误。诱变时没有把菌体稀释甚至是紫外照射时没有打开培养

20、皿的盖子，导致菌体长满平板，后续实验延迟。重新诱变，时间浪费。酶活力测定本次实验在酶活力的测定过程中，标准曲线的制作存在较大的误差，主要原因有一下几点：首先，是标准曲线制作的方法不标准，大多是来源于豆丁网的文档；其次，操作不规范，包括移液器的使用，分光光度计的操作等；最后是，仪器的误差。实验结果因菌种特性，接种量大小，培养时间，酶的稳定性，温度范围，平板厚度等均会影响平板水解圈直径大小，所以有一定的误差。绘制标准曲线时也会受到影响。7 实验总结及个人感想本次综合实验收获很多，主要是在理论知识，实验技能，团队合作三个方面提升较大。在理论知识方面，我们的收获主要是对理论课上学到的知识，通过实践更加深化地进行理解，加深印象，以及对一些实验的细节知识的学习。例如：对紫外杀菌，高压蒸汽灭菌的工作原理更加深刻的理解，