普通PCR及测序PCR原理

1、一一 PCR技术技术什么是什么是PCR? 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异片段的技术。 PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。PCR反应的几个要素反应的几个要素 DNA聚合酶聚合酶 生产机器生产机器 模板（要扩增的模板（要扩增的DNA） 引物引物 dNTPs 原料原料 Buffer（缓冲液）（缓冲液） 稳定的环境稳定的环境 Mg 2+ 等等 润滑剂润滑剂模具模具PCR反应步骤反应步

2、骤模板DNA95变性变性(denaturaion)50引物1引物2DNA引物退火退火(annealing)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延伸延伸(extension)第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA（1）第1轮扩增（2）第2轮扩增（4）第3轮扩增（8）第4轮扩增（16）第5轮扩增（32=232=25 5）标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L上下游引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L DNA聚合酶的主要活

3、性是在具备模板、引物、聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等等存在的情况下催化存在的情况下催化DNA的合成。的合成。Taq酶来自水生嗜热菌酶来自水生嗜热菌 Thermus aquaticus特点：特点：1.良好的耐热性良好的耐热性 在在7080具有最高聚合活性具有最高聚合活性 在在95 仍然可以有仍然可以有50%活性活性 2. Mg2+依赖性依赖性 3. 扩增时扩增时3末端凸出一个末端凸出一个A 碱基碱基 3. 无校正功能无校正功能3 （6 6）缓冲液（）缓冲液（BufferBuffer） 10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温

4、） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性 0.01% 明胶 保护酶不变性失活 一个典型PCR体系反应体系（50 ul）：Taq酶 2.5 U 10 x Buffer 5 uldNTP(2.5mM) 4 ulDNA模板 0. .12ug上游引物(10P) 2 ul下游引物(10P) 2 ul H2O 补足至50 ul总计 50 ul反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）： 95 5 min 95 30 s 55 30 s 72 1 min 72 5 min 4 -30个循环PCR的特点1.特异性强特异性强2.灵敏度高灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加

5、的，能将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10 -6)水平3. 简便、快速简便、快速 PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测 假阴性，无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 无扩增产物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.

6、引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4. 反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1. 纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2. 更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3. 重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4. 降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无； 非特异性扩增 现象：现象：

7、PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5

8、.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。 M 1 21.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP

9、和镁离子的和镁离子的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况) ) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：1. 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最

10、好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 （一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照（二）设立对照阳性对照：阳性对照： 阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照： 阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照： 除模板外的所有组分除模板外的所有组分注意的事项注意的事项：PCR的类型及应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他

11、PCR的不同类型的不同类型重组重组PCR 不对称不对称PCR 反向反向PCR 多重多重PCR原位原位PCR 连接酶链反应连接酶链反应巢式巢式PCR 递减递减PCR热启动热启动PCR RTPCR 实时定量实时定量PCR55 固定组织或细胞固定组织或细胞: :将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K K消化处理消化处理: :用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K.PCRPCR扩增扩增: :在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循

12、环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.杂交杂交: :PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交 人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 LCRLCR连接酶链反应连接酶链反应 LCR （Ligase chain reaction）基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增. 若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物. LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序

13、列的特异性结合，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右. 目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等. 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多的使用降低了扩增多个靶

14、位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。 巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的灵敏度，的灵敏度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5 RACE）的特异性。）的特异性。 递减递减PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR） 递减递减PCR通过在通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的特异性。循环设在比估算的TmTm高大约高大约5的退火温度下开始，的退火温度下开始，然后每个循环降低然后每个循环降低1 1-2 2, ,直到退火温度

15、低于直到退火温度低于Tm Tm 5。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。循环中继续扩增占据优势。 递减递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。热启动热启动PCR PCR （HotStart PCRHotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，合成，直到直到PCR 仪达到变性温度；仪达到变性温度； 现在有很多公司都有现在有

16、很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCR特异特异性最重要的方法之一。性最重要的方法之一。RT-PCRRNARNA的多聚酶反应（的多聚酶反应（RT-PCRRT-PCR）是以）是以RNA RNA 为模板，为模板，联合逆转录反应（联合逆转录反应（r reverse everse t transcriptionranscription，RTRT）与与PCRPCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于，可用于

17、检测单个细胞或少数细胞中少于1010个拷贝的个拷贝的RNARNA模板模板。RNARNA扩增步骤：扩增步骤：在在单引物单引物的介导下和的介导下和逆转录酶逆转录酶的催化下，合成的催化下，合成RNARNA的互补的互补cDNAcDNA加热后加热后cDNAcDNA与与RNARNA链解离，然后与另一引物退火，链解离，然后与另一引物退火，并由并由DNADNA聚合酶聚合酶催化引物延伸生成双链靶催化引物延伸生成双链靶DNADNA最后扩增靶最后扩增靶DNADNA逆转录酶聚合酶RNARNA杂合双链杂合双链PCR扩增RNAcDNA反转录引物反转录引物逆转录酶：逆转录酶：1.禽类成髓细胞病毒禽类成髓细胞病毒(AMV)逆

18、转录酶，活性包括依赖于逆转录酶，活性包括依赖于RNA的的DNA合成，依赖于合成，依赖于DNA的的 DNA合成以及对合成以及对DNA:RNA杂交体杂交体的的RNA部分进行内切降解部分进行内切降解(RNA酶酶H活性活性)。2.鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。反转录酶。 MLV反转录酶兼备依赖于反转录酶兼备依赖于RNA和依赖于和依赖于DNA的的DNA合成活性，但降解合成活性，但降解RNADNA杂交体杂交体中的中的RNA的能力较弱。的能力较弱。3.普通逆转录酶反应温度为普通逆转录酶反应温度为37-42度，所以反转录的延伸温度一度，所以反转录的延伸温度一般都是般都是37或或42 。逆转录反应

19、的一般步骤逆转录反应的一般步骤1.RNA模板模板+反转录引物，反转录引物，70，5min, 冰浴冰浴1min。2.再加以下反应组分：再加以下反应组分： Buffer dNTP 逆转录酶抑制剂逆转录酶抑制剂 逆转录酶逆转录酶3.以上组分加好后，混匀，以上组分加好后，混匀，42或或37 60min。4.70，5min 后再冰浴，所得产物就是后再冰浴，所得产物就是cDNA， cDNA用做后面的用做后面的PCR的模板。的模板。 一步法：一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、酶、4种种dNTP 直接进行直接进行mRNA反转录与

20、反转录与PCR扩增。发现扩增。发现Taq酶不仅具有酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而扩增，从而使使mRNA的的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于中小于1ng的低丰度的低丰度mRNA。该法可用于低丰度。该法可用于低丰度mRNA的的cDNA文库的构建及文

21、库的构建及特异特异cDNA的克隆，并有可能与的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。两步法：两步法：由于单管反应时由于单管反应时RT和和PCR都不能在最佳条件下进行并且都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量因，及定量PCR。两步法则是将。两步法则是将RT和和PCR分别进行，这分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严样使得两个反应充分发挥各自的

22、特点，更为灵活而且严谨，适合那些谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的模板，以及多个基因的RT-PCR。二二 、测序原理、测序原理 双脱氧核苷酸终止测序法（也叫sanger测序法）的原理是：在PCR体系中加入双脱氧核苷酸（ddNTP）， 在PCR延伸过程中ddNTP随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的PCR反应，生成一系列长度相差1个碱基的PCR产物混合物，此产物通过电泳根据不同长度片段的电泳速度不同来检测整段DNA的序列。dNTP与与ddNTP双脱氧终止法示意O碱基碱基CPOHH12345OHO碱基碱

23、基CPOHH12345双脱氧终止法示意脱氧核苷酸脱氧核苷酸（dNTP）的连接的连接O碱基碱基CPOHH12345OHO碱基碱基CPOH12345HDNA聚合酶聚合酶双脱氧终止法示意脱氧核苷酸（脱氧核苷酸（dNTP）的连接）的连接O碱基碱基CPH12345HDNA聚合酶聚合酶双脱氧终止法示意O碱基碱基CPOHH12345OH双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）双脱氧终止法测序反应组分 模板预备测序的双链或单链DNA 引物在模板上已知区域设计的测序引物，引物确定了测序的方向方向和位置位置 dNTP ddNTP脱去3端羟基的dNTP，并且4种不同的ddNTP上标记有4种不同颜色的荧光标记 DNA聚合酶 缓冲液为DNA聚合酶提供工作条件模板模板引物引物DNA聚合酶聚合酶测序组分示意图因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。测序反应示意图测序反应示意图 在引物延伸反应过在引物延伸反应过程中，程中，dNTP和和ddNTP是是相互竞争相互竞争地掺入到延地掺入到延伸链的伸链的3端的