兔软骨细胞培养法

1、兔软骨细胞培养法 软骨包括骨骺软骨和关节软骨，是由软骨细胞及其软骨基质构成的。软骨能扬骨骼之弹性和韧性之长，避骨骼之脆性之短，降低运动中骨与骨之间的摩擦，并具有减震作用。软骨与骨不同，软骨不含血管和神经，细胞又包埋于软骨陷窝里，是较易获得的均一软骨细胞。软骨基质是由软骨细胞产生和分泌的，主要由ii型胶原和蛋白多糖组成。软骨细胞埋藏于致密的糖蛋白软骨基质中，必需经过一系列酶消化才干获得少量软骨细胞，培养也较困难。从软骨组织的选材、软骨细胞的分别消化和培养，尤其是在传代培养中软骨细胞的功能会逐渐削弱和消逝。 【材料】 1组织来源未成年兔的膝关节。 2培养用液 famf12 培养液加入15% fbs

2、,2.3mmo1/l mgc12,100u/ml、100ug/ml，ph 7.6。 3. gey平衡盐溶液（gbss, ph 7.0)，加入100u/ml、100 ug/ml、100ug/ml制霉菌素。 4消化液及其他用液 0.2溶液（溶于gbss) ,0.5%睾丸透亮质酸酶（溶于gbss) , 0.25%胰蛋白酶溶液（溶于gbss)，过滤除菌，冰箱冻存备用；0.125溶液，用不含ca2+和mg2+的cmf-pbs液配制，过滤除菌，冰箱冻存备用；麻醉用液。 5器具等手术用刀、剪、镊，平皿、25 ml旋口试管、200目滤网等。 【办法】 1取材用麻醉兔，将未成年免胸部用脱毛剂脱毛，用、消毒，移至

3、试验台上，开胸取1段肋软骨及骨移行部（图4-10)，浸泡于gbss液中洗涤，移肋软骨于解剖板上，去除周围大部分软组织，用镊子夹持骨侧，用刀由骨侧向软骨侧剥离软组织，分别骨及软骨片（图4-10a)，浸泡于新gbss液中，最后分别出所有的骨与软骨片，于操作板上切开骨与软骨的连结部，切取近骨端侧一段略为透亮的软骨部分（长约23mm)，集中含生长软骨，余下的是静止软骨与透亮软骨（图4-10b)；另外，也可以取膝关节处的软骨。先用、消毒兔后肢膝关节，用手术刀从关节表面削下呈乳白浅蓝色、半透亮状略带弹性的软骨组织片，收集在含有gbss液的无菌平皿中。除去软骨表面的血液和残存的滑膜组织，反复清洗整洁；将肋软

4、骨或膝关节软骨组织片移入另一平皿内用剪刀将软骨充分剪成（12) mm3大小的组织块，用gbss清洗2次。 2透亮质酸酶消化分别软骨细胞收集所有切碎的软骨，除去gbss，加入4ml透亮质酸酶，室温下作用5分钟，除去透亮质酸酶，另外加入8ml新奇的于室温下作用10分钟，除去透亮质酸酶，用5ml gbss清洗组织碎块2次，然后移入25 ml旋口试管中。 3胰蛋白酶消化分别软骨细胞去除gbss液，分离用2ml 0.25胰蛋白酶溶液洗软骨碎块2次，去除用过的胰蛋白酶洗液，再加新奇的胰蛋白酶4ml，置37水浴中轻微振荡消化30分钟。去除胰蛋白酶，用gbss清洗2次，每次用5m1, 4胶原酶消化分别软骨细胞

5、用0.2胶原酶ii溶液2ml清洗5分钟，去除胶原酶洗液，加入4 ml 0.2胶原酶ii溶液，置37水浴中消化30分钟，去除上清液。加入4ml胶原酶ii溶液，置37水浴中消化90分钟。 5收集上清液以1500r/min离心8分钟，收集细胞团，将细胞悬浮于8ml含有15胎牛血清的f12培养液中，以500r/min离心1分钟，将上清液移入另一试管，以去除未消化的软骨基质。 6软骨细胞培养将收集的上清液以1500r/min离心10分钟，收集细胞用含有15胎牛血清的f12培养液再悬浮。按照细胞计数，调节细胞浓度为（110)x105个ml，接种培养瓶，置于37,5% c02、饱和湿度的c02孵箱中培养，每

6、2天换1次培养液，当细胞长满瓶壁后即可传代。 7软骨细胞传代培养取长满瓶壁的软骨细胞瓶，倒掉培养液，再用培养液轻轻漂洗1次贴壁的细胞，加入 0.125盖过细胞，置37下消化，当贴壁细胞表面含糊，镜下见细胞变圆时，当心倾出胰酶液，加入培养液后用吸管吹打簇拥细胞，按1分2分装培养瓶，补齐培养液后置37,5% c02孵箱中继续培养。 【结果】 1原代培养的软骨细胞消化分别的软骨细胞接种培养瓶，于10h左右开头贴壁，在倒置显微镜下观看，刚接种时的细胞为圆形，贴壁细胞开头生长、分裂增殖，待汇集成片时，细胞呈圆形、卵圆形和多角形，很像上皮样细胞（图4-11)，可形成具有折光行的细胞外基质。 2传代培养的软

7、骨细胞原代细胞经消化后传代培养，细胞可在610h贴壁，镜下见细胞形态从圆形变为多角形，细胞外基质增多，具有折光性。细胞传代至第3代以后，细胞生长旺盛，常见到分裂态的细胞；从传至第4代开头，多角形细胞逐渐变为梭形，向成纤维细胞样细胞改变。软骨细胞传至第6代以后，细胞形态则以梭形为主，但细胞的生长活性开头下降，分裂象细胞很少见，增生性活动几乎处于停顿。 3软骨细胞的鉴定软骨细胞的特征性分泌产物是酸性糖氨多糖，、和x型胶原等软骨基质，其中，酸性糖氨多糖可用组化法鉴定，即蓝染色成蓝染；分泌的,和x型胶原等可用已知的相应抗体举行免疫细胞化学染色，以呈阳性免疫染色反应来鉴定培养细胞是否具有软骨细胞的生物学

8、特性。 【注重事项】 1软骨细胞的培养较困难，尤其是细胞的分别过程，从软骨组织块的充分剪切，用透亮质酸酶、和胶原酶消化两遍以去除基质，再用胶原酶长时光消化，到控制消化反应温度和消化过程中轻微的振荡等，均有助于基质的分解与软骨细胞的分别。 2分别软骨细胞可采纳不同的消化液，胶原酶效果较好，可用于原代培养时消化软骨组织块的消化；胰蛋白酶也可用于软骨细胞的消化，主要用于传代细胞的分别。 3软骨细胞在呈弱碱性并增强mg2+浓度的培养基中易于生长，故挑选弱碱性的f12培养液并增添加mgcl2。普通只培养34代，培养3代以内的细胞仍可保持软骨细胞的生物学特性，若再继续传代，软骨细胞会逐渐失去其特异性表型，发生