分子定向进化技术

1、 molecular directed evolution赵亚兰11234主要内容分子定向进化技术的概述及定义分子定向进化技术的概述及定义分子定向进化技术的原理分子定向进化技术的原理分子定向进化技术具体过程分子定向进化技术具体过程分子定向技术的应用及展望分子定向技术的应用及展望2 人们试图利用结构生物信息学和定人们试图利用结构生物信息学和定点突变技术对蛋白质进行合理的改造，点突变技术对蛋白质进行合理的改造，这些方法难度较大且要在了解蛋白质的这些方法难度较大且要在了解蛋白质的三维空间的基础上才能进行。而分子定三维空间的基础上才能进行。而分子定向进化技术是在不需了解相关蛋白的三向进化技术是在不需了

2、解相关蛋白的三维空间结构的情况下在维空间结构的情况下在体外模拟体外模拟自然进自然进化的过程化的过程( (随机突变、重组和选择随机突变、重组和选择) )，使，使基因发生大量变异，并定向选择出所需基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能的蛋白。性质或功能的蛋白。3概概 述述 生物在漫长的时生物在漫长的时间里经过自发突变间里经过自发突变 (突变与重组突变与重组)，通，通过自然选择，逐渐过自然选择，逐渐形成了多样性的生形成了多样性的生物。物。基因在短时间通过基因在短时间通过人为引发突变，经人为引发突变，经过人工筛选，形成过人工筛选，形成满足人们需要的新满足人们需要的新功能或者优良性能功能或者优良性

3、能生物物质生物物质(酶蛋白酶蛋白)。分子定向进化分子定向进化 自然进化自然进化自发、不定向、自然选择、慢自发、不定向、自然选择、慢人为、定向、人工选择、快人为、定向、人工选择、快4一、分子定向进化技术的定义一、分子定向进化技术的定义 分子定向进化分子定向进化(molecular directed evolution)是在分子水平研究所需生物的是在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋白质，是在体外模拟特定基因或蛋白质，是在体外模拟突变突变、重组重组和和选择选择的自然进化机制，使进化朝的自然进化机制，使进化朝着人们需要的方向发展其实质，是达尔着人们需要的方向发展其实质，是达尔文进化论在分子水平上的延

4、伸和应用。文进化论在分子水平上的延伸和应用。5二、分子定向进化技术的过程原理二、分子定向进化技术的过程原理6通常通常通常一个典型的定向进化技术涉及三步通常一个典型的定向进化技术涉及三步: : 1.1. 通过通过随机突变随机突变和和( (或或) )基因体外重组基因体外重组创造基创造基 因因多样性，多样性，即即将目的蛋白的编码基因进行将目的蛋白的编码基因进行 突突 变或是随机重组产生一个含有多个基因变或是随机重组产生一个含有多个基因 的突变体库。的突变体库。2.2.导入适当载体后导入适当载体后构建突变文库构建突变文库；3.3.通过通过高通量的筛选高通量的筛选方法方法，选择阳性突变子。，选择阳性突变

5、子。这个过程可重复循环这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。，直至得到预期性状的酶。71.基因的体外突变基因的体外突变无性进化：无性进化：易错易错PCR；物理、化学方法介导的随机诱变；物理、化学方法介导的随机诱变；由致突变菌株产生的随机突变由致突变菌株产生的随机突变。有性进化：有性进化： DNA改组技术；改组技术；随机引物体外重组法；随机引物体外重组法；重叠延伸法。重叠延伸法。三、分子定向进化的具体选择策略三、分子定向进化的具体选择策略8易错易错PCR(Error Prone PCRError Prone PCR) 利用利用PCR过程中出现的碱基错配，过程中出现的碱基错配，对特定基因进行随

6、机诱变的技术。对特定基因进行随机诱变的技术。 9向反应体系中掺入核酸类似物向反应体系中掺入核酸类似物(如次如次 黄嘌呤核苷酸黄嘌呤核苷酸)限制其中一种核苷酸的用量，使聚合限制其中一种核苷酸的用量，使聚合 酶优先选择其他三种，从而增加错配酶优先选择其他三种，从而增加错配 率。率。 通过引物通过引物5 5端引端引入错配碱基，插入或入错配碱基，插入或 缺失一个或多个碱基。这种突变方法缺失一个或多个碱基。这种突变方法 是靶向的，突变发生在是靶向的，突变发生在DNADNA模板上预先模板上预先 确定的位置。确定的位置。向向PCR反应体系中引入突变的方法：反应体系中引入突变的方法：10 在在TaqDNA聚合

7、酶催化的聚合酶催化的PCR反应体反应体系中加入一定量的系中加入一定量的Mn2+替代天然的辅助替代天然的辅助因子因子Mg2+，由于，由于TaqDNA聚合酶缺乏校聚合酶缺乏校对活性对活性(3 3- -5 5外切酶活性外切酶活性)，其错配率会，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右。个突变左右。可以通过调节核苷酸、酶、可以通过调节核苷酸、酶、 镁离子等镁离子等的用量，并加入锰离子等来控制错配的的用量，并加入锰离子等来控制错配的程度。程度。11连续易错连续易错PCR(Sequential error-prone PCR)将第一次将第一次PCR扩增扩增的有

8、益突变作为的有益突变作为下一次下一次PCR扩增的扩增的模板，这样连续模板，这样连续反复随机诱变，反复随机诱变，使得每次获得的使得每次获得的少量突变进行积少量突变进行积累累而得到更重要而得到更重要的有益突变。的有益突变。12重叠延伸重叠延伸PCR(SOE-PCR)原理：原理：重叠延伸重叠延伸PCR 技术由于使用了具有技术由于使用了具有互补末端的引物，使互补末端的引物，使PCR 产物形成产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可简单的扩增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个迅速的将两个D

9、NA 片段连在一起，片段连在一起，用于融合基因的构建。用于融合基因的构建。135，5，3，3，5，A基因B基因3，5，abcda.不需要设计酶切识别位点，可将不同来不需要设计酶切识别位点，可将不同来 源的源的DNA识别位点连接起来构建融合基识别位点连接起来构建融合基 因；因；b.不需要经过接头处理连接酶，利用不需要经过接头处理连接酶，利用PCR 拼接基因；拼接基因；c.可进行高保真定点、定位突变，并且突可进行高保真定点、定位突变，并且突 变和重组可以同时进行；变和重组可以同时进行；d.容易产生随机突变，需要对容易产生随机突变，需要对PCR反应条反应条 件进行优化。件进行优化。 特点特点1516

10、DNA改组技术改组技术(DNA shuffling)又称又称有性有性PCR，指，指DNA分子的体外重组，分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因过改变单个基因(或基因家族或基因家族)原有的核原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。物以新功能。17从突变体基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组。18基因家族改组技术基因家族改组技

11、术(family shuffling)191. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性；4.延伸(重复2-4步)20几种不同突变方法产生的突变积累的情况比较21随机引物体外重组法随机引物体外重组法(RPR) RPR RPR 法是用一套随机序列引物法是用一套随机序列引物, ,产生产生互补于模板不同位点的短互补于模板不同位点的短DNADNA片段库片段库( (由于由于碱基错配碱基错配, ,这些短这些短DNADNA片段含有少量的点突片段含有少量的点突变变),),然后进行类似于然后进行类似于DNADNA改组的全长基因改组的全长基因装配反应装配反应, ,获得突变文库。获得突变文库

12、。特点：特点：是可用单链是可用单链DNADNA或或mRNAmRNA作模板、不作模板、不受模板长度限制。受模板长度限制。222.突变基因文库的构建突变基因文库的构建构建基因文库首先考虑的因素：构建基因文库首先考虑的因素：文库的质量文库的质量文库的代表性文库的代表性突变基因的结构完整性突变基因的结构完整性文库容易筛选文库容易筛选文库的大小与特定的筛选容量相适应文库的大小与特定的筛选容量相适应23突变体基因的载体系统突变体基因的载体系统噬菌体载体系统噬菌体载体系统优点：插入片段的装载容量大，适合于大片优点：插入片段的装载容量大，适合于大片段的克隆段的克隆构建出的基因文库质量高、代表性构建出的基因文库

13、质量高、代表性好、适合好、适合长期保存。长期保存。缺点：可选用的筛选方法较有限缺点：可选用的筛选方法较有限24质粒载体系统质粒载体系统优点：体外操作简便，优点：体外操作简便，最大优点是能实现对基因文库的功能性筛选最大优点是能实现对基因文库的功能性筛选缺点：是插入片段的载体容量较小，含有缺点：是插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克隆的群体扩增过程中容易长片段的重组克隆的群体扩增过程中容易丢失、转化效率普遍较低，不易长期保存。丢失、转化效率普遍较低，不易长期保存。25突变体基因文库的筛选突变体基因文库的筛选特点：筛选方法必须灵敏，可借助相关仪器特点：筛选方法必须灵敏，可借助相关仪器实现高通量

14、筛选，一般根据目的基因表达的实现高通量筛选，一般根据目的基因表达的靶蛋白选择筛选的方法靶蛋白选择筛选的方法活体筛选法活体筛选法;噬菌体展示法；噬菌体展示法；细胞表面展示法；细胞表面展示法；核糖体展示技术；核糖体展示技术；26几种高通量筛选的方法：几种高通量筛选的方法：1. .突变微生物分离法：突变微生物分离法： 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因特定反应的出现等判断是否具有目的基因。2.微球细胞固定法与数字成像系统结合法：微球细胞固定法与数字成像系统结合法

15、： 将单个细胞附着在单个固体珠上，对将单个细胞附着在单个固体珠上，对突变体进行分离和筛选。突变体进行分离和筛选。273.3.噬菌体展示技术：噬菌体展示技术： 外源蛋白以融合形式与噬菌体的外壳外源蛋白以融合形式与噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面蛋白共同表达于噬菌体表面,经过“吸附洗脱扩增”过程过程，可筛选并富集外源肽，可筛选并富集外源肽，进而研究其功能。进而研究其功能。4.4.流式细胞计数法：流式细胞计数法： 细胞经荧光染色后，通过高速流动系细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定进行测定。28(1)噬菌体展示技术噬菌体

16、展示技术(Phage Display) 突变突变DNA片段插入噬菌片段插入噬菌体或噬菌粒的基因组中体或噬菌粒的基因组中，以以融合蛋白的形式与噬菌体的融合蛋白的形式与噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌表外壳蛋白共同表达于噬菌表面，经过面，经过“吸附吸附洗脱洗脱扩扩增增”能够特异吸附产物的层能够特异吸附产物的层析柱析柱,带有活性蛋白的噬菌体带有活性蛋白的噬菌体被分离出来被分离出来。 29 有有细菌细菌和和噬菌体表面展示噬菌体表面展示技术，结合荧光激技术，结合荧光激活细胞筛选仪活细胞筛选仪(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)或流式细胞仪或流式细胞仪(flo

17、w cytometry)是是非常有效的高通量筛选方法非常有效的高通量筛选方法 。该技术是目前惟一。该技术是目前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。还能够决定突变体库中每个克隆的功性的方法。还能够决定突变体库中每个克隆的功能特性能特性 。 细菌细胞表面展示技术细菌细胞表面展示技术(Bacterial CellSurface Display) 30四、分子定向进化技术的应用四、分子定向进化技术的应用1.在环境污染治理方面的应用在环境污染治理方面的应用 相关基因通过多轮相关基因通过多轮DNA改组和筛选，分离改组和筛选，分离得到的突变体可提

18、高对甲基对硫磷、对三氯丙得到的突变体可提高对甲基对硫磷、对三氯丙烷、烷、 三氯乙烯、五氯苯酚的降解。三氯乙烯、五氯苯酚的降解。2.农业饲料酶制剂的中的应用农业饲料酶制剂的中的应用 如木聚糖酶如木聚糖酶(最适最适pH和耐高温和耐高温)；高比活低；高比活低pH淀粉酶；耐碱耐高温高活性的纤维素酶；耐淀粉酶；耐碱耐高温高活性的纤维素酶；耐高温的二塘水解酶高温的二塘水解酶.通过易错通过易错PCR和和DNA改组改组技术均可获得相应能较野生型功能强的酶制剂技术均可获得相应能较野生型功能强的酶制剂。313. .酶制剂药物方面的应用酶制剂药物方面的应用 主要是对酶制剂药物进行分子改造，主要提高主要是对酶制剂药物

19、进行分子改造，主要提高其活性和稳定性其活性和稳定性4.4.抗生素生产的相关限速酶活力方面提高抗生素生产的相关限速酶活力方面提高 如各种抗生素合成路径中的关键酶活性的提高，如各种抗生素合成路径中的关键酶活性的提高，从而增加相应物质产物的产量，这一过程可以单从而增加相应物质产物的产量，这一过程可以单独使用易错独使用易错pCR技术也可以结合技术也可以结合DNA重组技术进重组技术进行分子定向进化。行分子定向进化。32 头孢菌素头孢菌素C(CPC) 和和7- 氨基头孢烷酸氨基头孢烷酸(7-ACA)分别是工业半合成生产头孢菌素类分别是工业半合成生产头孢菌素类抗生素的重要前体和中间体，由于在顶头抗生素的重要

20、前体和中间体，由于在顶头孢霉中中直接生产孢霉中中直接生产7-ACA 也存在酶表达和也存在酶表达和菌株培养最适条件的矛盾，因此，采用易菌株培养最适条件的矛盾，因此，采用易错错PCR技术对技术对CPC 酰化酶进行定点突变，酰化酶进行定点突变，从而提高从而提高CPC的转化效率。的转化效率。33头孢菌素头孢菌素C(CPC) 戊二酰基戊二酰基-7-氨基头孢烷酸氨基头孢烷酸 （GL-7-ACA)D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶头孢头孢C氨基酰化酶氨基酰化酶7- 氨基头孢烷酸氨基头孢烷酸(7-ACA)34易错易错PCR 对对CPC 酰化酶进行无性突变酰化酶进行无性突变突变重组子的初筛与复筛突变重组子的初筛与复筛将易错将易错PCR所得到的基因所得到的基因ecs与适宜的载体连接与适宜的载体连接易错突变子的结果分析易错突变子的结果分析35 用易错用易错PCR，用不同浓度的，用不同浓度的Mg2+ 和和Mn2+，应，应用低保真用低保真DNA聚合酶，以一定的频率向氨基酰化酶聚合酶，以一定的频率向氨基酰化酶基因基因(ecs)中引入随机突变。由于希望获得错配的中引入随机突变。由于希望获得错配的ecs 基因序列，因此采用了基因序列，因此采用了Mg2+ 浓度浓度7.5 mmol/L、