OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的试验方法

1、O P T I - MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次相关专题无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题 分析。贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO贴壁细胞）2、脂质体 LIPOFECTAMINE2000（invitrogen 公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基 OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen 的LIPOFECTAMINE200说明书上列举了 24孑L、12孑L、6孔板

2、的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是 34*105/ml.）转染时，细胞要达到9095%勺融合。2、 溶液 1: 240ul 无血清培养基 +10ullipofectamine2000perwell（总体积 250ul）（温育 5min）3、溶液2: Xul无血清培养基+4ug质粒perwell（总体积250ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。5、 与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后， 加入2ml 无血清培养基。&a

3、mp;将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在 37C, 5%勺C02中保温56小时。7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在 37C, 5%勺C02中 4872h检测 转染水平。8、如果做稳定转染，换全培养基培养后 24h，即可以1: 10或更高的稀释 比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的， 有了经验之后，现在做转染得 心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化， 几乎没有细胞死亡。转染率很高。 以下是个人经验，与大家分享。1. 细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生

4、长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做， 那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。2. 细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到 90%才能做，细胞太少，容易死 的。3. 无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO很好用，有条件的话，就用它代替 PBS 洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEMf PBS或无血清的DMEM前者的转染效率确 实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转 动培养板让液体滚动在细胞表面。 如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂 质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。4. 加入无

5、血清培养基后56小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过 长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！5. 转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。6.48小时mRN表达最高；72h蛋白表达最高。加转染试剂(Opti-MEMI),细胞就浮起或死亡问题分析？各位前辈：我想把microRNA转到成纤维细胞内，用的是GIBCO(tm)Opti-MEMIReduced-SerumMedium(1X和 Lipofectamine?2000 转的。现 在的问题是一加转染试剂细胞就大量死亡。Opti-MEM和冲洗用的PBS都 37度预热过的。甚至我用

6、无血清的 DME对照也大量死亡。有时细胞死亡稍微好点，是 不是和细胞批次关系更密切，还是有其他原因。我的实验操作：110%t清DMEI接种细胞在24孔板，长至3050%满底时进行转染。2lipofectami ne20000.5ul 稀释于 25ulOpti-MEMIReduced-SerumMedium(1X)(GIBCO)静置 5 分钟3microRNA10pM稀释于 25ulOpti-MEM4混匀2和3,力卩Opti-MEM至500ul。室温静置30min。5用PBS室温)轻轻冲洗培养空，镜下观察部分细胞略变圆(或有变圆倾向)， 但没什么细胞浮起。吸去PBS轻轻加入2和3的混合物。镜下观

7、察，即刻细胞 大量浮起，或细胞挛缩，有细胞死亡倾向。6h后证实细胞大量死亡。但有细胞干死在培养皿底的印迹。不同批次的细胞，死亡情况略有不同。问题分析：1. 不是说明书上说什么你就做什么，你是有自主意识的。2. 你的细胞加opti-MEM就不好有两种可能：a。你养的细胞有问题，或者有 共生菌，改变培养条件就可能爆发;b。你的细胞对opti-MEM敏感。为什么一定 要用opti?你没有自己的主见吗？3. 你的转染有问题。从你的描述来看，你并不是接种后 24hr左右立即做转 染，而是让它长到50流右，也就是如果不到50%你也许会长更久，对吗？一一 这是转染实验的大忌，超过24hr细胞对转染会不敏感，

8、转染效率下降。4. 你转染时选择的细胞丰度也没有太大的问题，但是这个也是具体问题具体 对待。像HeLa是绝对要30%右的，就是这样48hr 后,细胞已经铺得密密麻麻； 就不要想95%T，那样的细胞只能扔掉，一天换几次新鲜的培养基也跟不上培养 基变黄的速度。需要参考的东西包括你细胞原本的生长速度，对lipo2K的敏感程度（被抑制和毒死的情况，我可以负责任的告诉你lipo2K非常毒，他们的lipo2K是稀释到33%勺产品，他们100%勺lipo2KCD是另卖的，其中原因之一就 跟毒性有关，没有多少细胞能耐受），总之要确保你的细胞在24hr长到合适的浓 度做转染，转染40-48hr后铺满孔，或多或少一点点也可。5. 由于lipo2K毒性很高，如果实在不合适，你应该考虑更换其他的转染试 剂；此外，应该用你的平时养细胞的培养基做转染，不过记得去除抗生素，另外 稀释lipo2K和质粒的培养基要去血清去抗生素的。6. 无血清细胞处于一种应激状态，本来就长不好，这时候你投毒，当然更差。lipo2K不是不计较培养基是否有血清吗， 所以在“双无”培养基稀释lipo2K和 RNA形成复合物后可以投到含血清的无抗生素的培养基中。实际上我们转染用 的培养基，double血清含量（普通5%转染用10%早期lipo的说明书要求“双 无”，3hr后添加double血