免疫抑制剂姜黄素逆转胰岛素抵抗

1、免疫抑制剂姜黄素逆转胰岛素抵抗【摘要】 【目的】 为探讨姜黄素(curcumin)对胰岛素抵抗的治 疗作用及其机制。【方法】利用胰岛素抵抗的小鼠模型，观察姜黄素对小鼠胰岛 素抵抗的水平、转录因子I-?资B?琢、循环细胞因子的变化。【结果】 姜黄素 能抑制TNF?琢刺激Fao细胞NF-?资B激活；姜黄素治疗后小鼠的空腹血糖水平 没有明显下降，但空腹胰岛素的水平下降约30%葡萄糖耐量曲线的水平也明显 下降；循环中TNF?琢( ± )pg/mL vs ( ± )pg/mL水平没有明显改变,而IL-1? 茁(± )pg/mL vs ( ± ) pg/mL 和 I

2、L- 6 ( ± )pg/mL vs ( ±) pg/mL水平明显 被抑制;胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高，而胰岛素受体的 磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行，P85的磷酸化水 平也明显升高，AKT的磷酸化的水平也明显升高。【结论】姜黄素能提高小鼠胰岛素敏感性，有治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗的作用。【关键词】 姜黄素；NF-?资B;胰岛素；抵抗)Abstract:【Objective 】 To investigate inhibitory effect ofcurcu min and its mecha nism on in sul

3、in resista nee.【Methods Curcu minco-operated high fat diets were tested for the effect of curcu min on obesity in duced in suli n resista nee in rode nt model. Tran scripti on factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment.【Results 】(1) Curcumin inhibitedTNF?琢-stimula

4、ted NF-?资 B activationin Fao cells. (2)The fast ing plasma glucose level was not obviously decreased after the treatme nt of curcu min, but the level of fast ing in sulin decreased by about 30%. Furthermore, the level of glucose toleranee curve dropped significantly.(3) The level of TNF?琢( ± )p

5、g/mLvs ( ±) pg/mL in circulation was not obviously changed, but the level of IL-1?茁(±) pg/mL vs ( ±) pg/mL and IL -6 ( ±) pg/mL vs ( ±) pg/mL was suppressed dramatically. (4) IRS-1 tyros ine phosphorylati on levels stimulated by in suli n obviously in creased, but the phosph

6、orylati on level of in suli n receptor did not cha nge. Being parallel with tyros ine phosphorylati on levels of IRS-1, the phosphorylatio n levels of P85 and AKT in creased accordi ngly. Sign ifica ntly improved in suli n sen sitivity was observed in groups with curcumin.【Conclusion 】 Curcumin inhi

7、bitsNF-?资 B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced in suli n resista nee.Key words:curcu min, NF-? 资 B, i nsuli n, resista nee姜黄(Curcuma longa L.)是常用中药，临床上用于活血、行气、通经、 止痛。姜黄素(curcumin)是一种黄色色素，从姜黄中提取得到的主要有效成分。 近年来,大量研究发现它具有免疫调节、抗氧化、抗炎及抗肿瘤、抗动脉粥样硬 化等生理和药理作用1-4。在实验室资料中姜黄素是良好的免疫调节剂，并有

8、结 果提示姜黄素可以抑制宿主抗移植物反应，而且提高受体动物的存活率5,6。在 实验研究中，炎症又与胰岛素抵抗密切相关7,8。炎症被证实是代谢综合征的共 同土壤,联想到许多抗炎药物如阿司匹林可以逆转胰岛素抵抗，本文尝试利用姜黄素治疗肥胖合并极度胰岛素抵抗的炎症模型，并对姜黄素逆转胰岛素抵抗的机 制作初步探讨。1 材料与方法材 料姜黄素购于印度亚洲公司(纯度99%)。动物Obob雄性小鼠16只,8周龄、空腹体质量(3338 g),购自南京国家模式动物中心，用含脂肪勺标准饲料饲养，实验前1周纪录小鼠的 饲料摄取、空腹血糖、空腹胰岛素水平及体量等。FAO 细胞 购自 The American Type

9、 CultureCollection(ATCC)。试剂 IR、IRS-1、AKT P85 多克隆抗体由 Steven Shoelson 实验室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBSTNF琢、胰岛素购自 Sigma, St. Louis USA, I-? 资 B?琢 抗体,IKK?酌抗体，购于 Santa Cruz, CA, GST-I-? 资 B(1-54)底物由 Bost on Biologicals, Wellesley, MA 合成。方 法体外细胞实验FAO细胞使用培养液DMEM购自Gibco公司),细胞置于37 C,5%CO2勺培养箱中培养。在1

10、0 cm培养皿用10 mL DMEM+10%FBS 含有高浓度葡萄糖(25 mmol/L)的培养液中培养至80%重叠率，经5 mL %BSA?育 16 h后接受不同浓度(040 umol/L)的姜黄素预处理，然后接受鼠TNF琢10 nmol/L刺激处理，于20 min后用预冷的PBS终止，并收集细胞，用于制作蛋白匀 浆,备用,I-?资B?琢的水平用免疫印迹的灰度表示。NF-?资B的活性用20 min 内试验细胞和对照细胞I-?资B?琢灰度差值表示。动物实验利用食物参入法制成含2%姜黄素的颗粒饲料(LabDiets, 5008),低温保存。动物饲养环境为中央通气，层流环境，恒温(23 C)、恒

11、湿,12 h明暗光照循环,24 h随意饮食环境.动物购入后第5天开始接受口服葡 萄糖耐量试验，并留取空腹血浆作血浆胰岛素水平，和其它循环因子的检查。在验 证空腹血糖和胰岛素水平后动物被随机分成两组 ，并接受姜黄素治疗，对照组用 颗粒饲料5008作为对照。每天记录动物的摄食量，每3周测量空腹血糖并留取空 腹血浆1次，第6周空腹状态下进行第2次口服葡萄糖耐量试验，并留取空腹血 浆。试验后继续接受姜黄素治疗,第7周于空腹状态下接受5 U/kg胰岛素富强注 射,注射后5 min整,用断颈法迅速处死动物,留取肝脏经液氮过渡后在-80 C低 温冰箱保存，作胰岛素信号分析之用。血浆多种循环炎症细胞因子的检查

12、用Li neo Research 的Lumi nex试剂盒并采用Lumi nex 200监测结果。免疫印迹细胞或组织裂解液（30 mmol/L Hepes, 150 mmol/LNaCI, 1% Triton X-100, pH。蛋白酶抑制剂由 1 mmol/L PMSF, 3 ?滋 mol/Laprotinin, 5 ?滋 mol/L pepstatin,10 ?滋 mol/L leupeptin, 25 mmol/LBen zamid in, 2 mmol/L Na-va nadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10mmol/L NaF, 1 mmol

13、/L Ammon ium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA）裂解细胞，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（6%）,蛋白加热 变性后每孔加30 ?滋g,电转移仪将蛋白转到PVDF!。5%兑脂奶粉TBS-T缓冲 液洗膜，加一抗，4 C孵育过夜,TBS-T缓冲液洗膜，加过氧化物酶标记的IgG抗 体（购自AmershamUSA）,室温1 h,TBS-T缓冲液洗膜，加ECL1 min,暗室显影23 min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像。统计学分析 采用t检验。2 结 果2. 1姜黄素抑制NF-?资B的量效和时效关系Fao细胞

14、在10 cm2培养皿用10 mL在10%FBS+DMElM有高浓度葡萄糖 的培养液中培养至80%重叠，经5 mL % BSA孵育16 h后接受姜黄素预处理：剂量 关系用梯度浓度如图1所示，时效曲线用30卩mol/L。预处理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激处理，于20 min后用预冷的FBS终止，并收集细胞，用于制作蛋白匀 浆。用免疫印迹检测匀浆内I-?资?注?琢的水平。如图1A所示:20卩mol/L姜黄 素20 min预处理能够抑制TNF刺激的I?资?注?琢的降解。从姜黄素的时效关系 图1B可见，姜黄素有效剂量30卩mol/L对NF- k B的抑制作用在3060 min时最 强。2. 2

15、姜黄素以逆转肥胖小鼠的胰岛素抵抗经过6周姜黄素的治疗，小鼠的空腹血糖水平没有明显下降，但空腹胰 岛素的水平下降约30%（图2）, 口服葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降（图2A）,曲 线下面积的比较有明显差异（P< ）。由空腹血糖和胰岛素水平计算的 HOM指数用FBS(mmol/L) x胰岛素(mmol/L)/计算也呈明显降低(P< ,图2C),提示小鼠对胰岛素抵抗的水平得到明显改善。2. 3姜黄素对循环细胞因子的影响Obob小鼠治疗6周后的空腹血浆用Li neo Research Lumi nex 试剂盒 同时检测细胞因子IL-1?茁,IL-6 和TNF?琢的水平。如图3所示：尽管循

16、环胰岛 素的水平明显下降，但TNF?琢 ( ± )pg/mL vs ( ±) pg/mL水平没有明显改变， 与之对应，循环中 IL-1?茁(± )pg/mL vs ( ±) pg/mL 和 IL-6 ( ± )pg/mL vs (±) pg/mL水平明显被抑制(P< ) o2. 4姜黄素为胰岛素信号的增效剂经胰岛素刺激的肝脏组织在液氮下作粉碎并以1%Trit on X100 RAPA含有全部蛋白酶抑制剂，和蛋白磷酸酶抑制剂)缓冲液在冰点匀浆。经全速4 °C离 心30 min取上清液(1 mg蛋白质)作IRS-1和IR联

17、合免疫沉淀。经上样缓冲液 释放的沉淀目标蛋白质经 6%勺SDS-PAGE分离,转移到PVDF1上。用4G10P85 AKT抗体作免疫印迹。如图4所示：胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明 显升高，而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。 与IRS-1酪氨酸的磷酸化水 平平行,P85的磷酸化水平也明显升高,AKT的磷酸化的水平也明显升高。3 讨 论胰岛素抵抗(IR)及胰岛？茁细胞功能减退是2型糖尿病发病机理的重要 环节，目前被认为是一个慢性非特异性炎症过程，胰岛素对胰岛素敏感组织作用 的缺陷(肝脏、脂肪组织、骨骼肌)会导致慢性、低水平炎症状态的恶化，任何与 慢性炎症有关的过程都会削弱胰岛素的

18、作用，作为恶性循环，胰岛素抵抗又会使 炎症恶化。在抗炎药物对胰岛素抵抗有逆转作用的报道之后，我们探索新的抗炎 药物对胰岛素抵抗的治疗作用，姜黄素是继阿司匹林后又一个具有类似协同作 用的活性成分11 o在姜黄素治疗6周后,尽管治疗组和对照组的体重没有明显 改善，但小鼠空腹血糖的水平明显下降，而且胰岛素的水平也明显降低，提示胰岛 素的敏感性明显升高，葡萄糖耐量曲线在治疗后也明显改善，说明小鼠整体对葡 萄糖的处理能力明显升高，即obob小鼠的胰岛素抵抗的水平得到明显改善。这 些都进一步说明姜黄素治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗。研究证实NF-?资B是启动和控制炎症的主要核转录因子,在非激活条件 下,NF

19、-?资B和胞浆内一种被称为NF-?资B的抑制物(I-?资B)的蛋白质结合处于 无功能状态。我们利用胰岛素敏感组织来源的细胞系FAO验证了姜黄素能够抑制TNF?琢刺激的I?资B?琢的降解,继而抑制NF-?资B的活性，我们推测在高度 肥胖NF-?资B高度激活的肥胖小鼠obob体内,姜黄素可能具有更加明显的改善 代谢的作用。在NF-?资B激活的模型上我们证实炎症激发的高水平循环细胞因子是 系统性胰岛素抵抗的原因。采用细胞因子的中和抗体可以逆转胰岛素抵抗，在NF-?资B抑制型模型,胰岛素敏感性升高,而且循环中细胞因子的水平较低。在肥 胖发生过程中,NF-?资B活性与动物的体重呈正相关。Obob小鼠的肝

20、脏，脂肪以 及淋巴组织中NF-?资B的活性水平升高，循环细胞因子的水平增高，这些都说明 炎症介质与胰岛素抵抗的关系。经姜黄素治疗的肥胖动物循环中细胞因子IL-1,IL-6水平均明显下降,由于IL-1和IL-6是NF-?资B活性调控的重要因子,因此， 我们认为姜黄素在胞浆内有多个作用靶点，通过对上述细胞因子的抑制作用，影 响NF-?资B的活性,继而达到逆转胰岛素抵抗和改善胰岛素敏感性的作用。在肝脏组织的胰岛素信号检测中，胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸磷酸化的水平明显升 高,AKT的活性也明显增强。这些结果都进一步说明肥胖小鼠胰岛素的敏感性在 治疗后得到了改善，姜黄素能提高obob小鼠胰岛素的敏感性

21、，姜黄素作为一个免 疫调节剂用于抑制免疫排斥的同时，对系统性炎症也有抑制作用，可能是通过抑 制NF-?资B来改善胰岛素敏感性的。【参考文献】HUANG H C, JAN T R, YEH S F. I nhibitory effect of curcumi n, anan ti-i nflammatoryage nt, on vascular smooth muscle cell proliferati on J.Eur J Pharmacol, 1992, 221(3):381-384.CHENH W, HUANG! C. Effect of curcumin on cell cycle p

22、rogression and apoptosis in vascular smooth muscle cells J. Br J Pharmacol, 1998, 124 :1029-1040.SIDHU G S, MANIH, GADDIPATI J P, et al. Curcumin enhances wou nd healing in streptozotocininduced diabetic rats and genetically diabeticmiceJ. Wou nd Repair Rege n, 1999, 7(7):362-374.NAITO M, WU X, NOMU

23、RA H,et al. The protective effects of tetrahydrocurcu min on oxidative stress in cholesterol-fed rabbits J. J Atheroscler Thromb, 20XX, 11(9):243-250.SHARMA；, CHOPRK, KULKARNS K,et al. Resveratrol and curcumin suppress immune resp onse through CD28/CTLA-4 and CD80 co-stimulatory pathway J. Clin Exp Immu nol, 20XX, 147(7):155-163.JAGETIA G C, AGGARWAL B B. “Spicing Up ” of the Im