结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析

1、结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析         【摘要】  探讨四川地区结核患者结核分枝杆菌基因分型及其与耐药性关系。方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,对124株结核分枝杆菌的6个可变重复位点进行检测,并应用Gel-Pro analyzer 3.0软件和BioNumerics(Version 3.0)软件对检测结果进行基因型分析,同时分析其基因型与耐药之间的关系。结果 124株结核分枝杆菌共分为37个不同的VNTR类型,成簇基因型占74.19%（92/124），单一基因型占25.81%（32/12

2、4）。耐药菌株在成簇类型和单一类型的分布上存在统计学差异。结论 四川地区结核患者的结核分枝杆菌具有明显的基因多态性，成簇类型是主要流行菌株，应加强流行结核菌株的监控。 【关键词】  结核 结核分枝杆菌 基因分型   Abstract：Objective To study on genotyping of Mycobacterium tuberculosis(MTB) isolates and to analysis the relation between drug resistance and genotype of Variable number tandem

3、 repeat(VNTR)in Sichuan area.Methods Six tandem repeat loci of the 124 isolates of M.tuberculosis in Sichuan area were analyzed by PCR and agarose gel electrophoresis.The results of genotyping were analyzed with Gel-Pro analyzer 3.1 software and BioNumerics 3.0 software,and the relation between gene

4、tic type and drug resistance was explored.Results A total of 37 different allele profiles were identified by the VNTR for all the 124 isolates,74.19%（92/124）and 25.81%（32/124）belonged to cluster type and single type respectively.Drug resistant M.tuberculosis was significantly associated with cluster

5、 type.Conclusion There is obvious genetic polymorphism in the M.tuberculosis isolates in Sichuan area.And the clustering type was perhaps the main epidemic strains.It is suggested that surveillance of the epidemic genotype to be strengthened.   Key words:tuberculosis；Mycobacterium tubercul

6、osis;genotyping   结核病仍然是一种严重危害人类健康的重大传染性疾病，特别是耐药结核分枝杆菌的发生和流行，给结核病的治疗、预防和控制带来巨大困难。目前，随着分子生物学的发展，可变数目串联重复(variable number tandem repeat ，VNTR) 分型技术由于其操作方法简单，并能提供数字式的分型信息,具有很高的可重复性，在实验室内和实验室间具有非常好的可比性，可以同时对大量样本进行分析，因此，该技术广泛应用于结核杆菌的基因分型。所以，本研究通过对农村结核分枝杆菌基因分型和耐药性以及不同基因型与耐药性的相互关系研究，为我国结核分枝杆菌的分子流

7、行学和结核耐药人群的监测提供重要的参考依据。   1  材料与方法   1.1  菌株来源   临床菌株来源:124株结核分枝杆菌菌株由四川结核病防治所提供的结核患者的临床分离株；结核分枝杆菌标准菌株H37Rv 购自中国药品生物制品检定所。   1.2  主要实验试剂   Taq DNA 聚合酶、dNTP、GoldViewTMDNA 染料均购自华美生物工程公司；实验中所用PCR 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；100bp DNA ladder购自Biorad生

8、物工程公司。   1.3  主要实验仪器   生物安全柜，Baker公司；培养箱，上海一恒科技有限公司；台式高速离心机，Eppendorf公司；DNA自动扩增仪，Eppendorf公司；恒压恒流电泳仪， 北京东方仪器厂和凝胶成像系统，英国Uvi公司等   1.4  结核分枝杆菌DNA的制备   采用常规L-J培养基培养，在生物安全柜中取生长良好的结核菌菌落溶于500 l TE(pH8.3)并密封；然后在旋涡振荡器上振荡至块状固体菌落均匀溶于TE中,沸水浴30 min，快速离心,取上清备用。

9、60;  1.5  重复位点的选择   参照文献国内外报道15,依据其多态性分析结果,确定了6个串联重复基因位点,其中包括3个ETR(exact tandem repeat)位点和3个MPTR(major polymorphic tandem repeat)位点(见表2-2)。实验中以标准测序株H37Rv为对照并以其实验结果获得相对分子质量大小。   1.6  VNTR-PCR   采用25ulPCR反应体系。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶恒电压(10 v/cm)电泳,GoldViewTM染料染色,应用10

10、01 000bp DNA ladder确定PCR产物的分子量大小。   1.7  菌种鉴定和药物敏感性试验   1.8  结果判定   以参照菌株H37RV拷贝数为参考，根据待测样品个位点的PCR 扩增产物的大小(bp数)确定每个位点相应串联重复单元的重复次数,然后计算每个菌株相应位点的重复次数,即VNTR等位基因类型。根据VNTR方法获得的基因型确定分离株是成簇还是单一类型。基因型相同的分离株为成簇,而基因型与本研究中的其他任何分离株均不匹配则为单一基因型。    

11、0;       1.9  统计软件   BioNumerics (Version3.0)统计分析软件；SPSS（12.0）统计软件包。   2  结果   2.1  124株临床分离株的菌种鉴定结果   采用鉴别培养基PNB和TCH对124株临床分离菌进行鉴定，根据菌株在培养基上生长情况来鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核性分枝杆菌，结果显示124株临床分离株均为结核分枝杆菌。   2.2  124株结

12、核分枝杆菌的药敏结果   研究菌株通过培养基培养结果显示：完全敏感菌株（对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇均敏感）有92株，占74.19%（92/124），耐药菌株32株，占25.81%(32/124)。   2.3  124株结核分枝杆菌VNTR结果   根据国外研究结果，本研究选取了8个基因位点，并对124株结核分枝杆菌进行VNTR检测，以H37RV标准株作为对照，选取100bp DNA Marker作为分子量参照，其分子量从小到达依次为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp

13、、800bp、900bp、1 000bp和1 500bp共11个分子量标准带。结果显示不同菌株的VNTR DNA指纹图谱在同一位点的扩增片段大小不同，不同菌株在不同位点的DNA指纹图谱也呈现出多态性，见图16.   2.4  不同菌株的VNTR位点的重复次数和位点的等位基因多态性   根据不同菌株的VNTR指纹图谱，以H37Rv标准株为参考，对其他待检菌株的DNA条带进行选点，计算其分子量的大小,然后计算出每个菌株在不同位点的重复次数。同时对分析124株结核分枝杆菌的6个基因位点的等位基因多态性，其结果显示：各位点呈现不同的等位基因多态性，MT

14、UB21位点的多态性最高，为0.575,ETR-B位点的多态性最低,为0.309,见表1.   2.5  菌株VNTR基因分型   对124株M.TB菌株检测的6个VNTR位点的重表1  各VNTR位点等位基因多态性表2  成簇和单一基因型的耐药率比较表3  成簇类型与单一类型与其他因素之间关系复次数采用BioNumerics（Version3.0）软件进行聚类分析。研究结果显示：124株M.TB菌株可分为37个基因型（H37Rv为参照株），其中32例患者的分离株为单一基因型；其余92例患者的菌株可归入5个簇，各簇

15、含256株，其中3个簇含15株以上。成簇最高的有型含45.16%（56/124）分离株；型占12.90%（16/124）分离株；型占12.1%（15/124）分离株；型占2.42%(3/124)；型占1.60%(2/124)；见图7.   2.6  VNTR基因分型与结核分枝杆菌耐药性关系   根据聚类分析结果和药物敏感实验结果，将124株结核分枝杆菌按照敏感和耐药分类，基因型分为成簇类型和单一类型，结果显示：耐药菌株在成簇类型和单一类型的分布上存在统计学意义(2=99.232,P=0.000)，见表2；成簇类型和单一类型之间的分布在不同年龄、

16、不同治疗史和不同涂片结果的患者间均存在统计学差异,但在性别等其他因素上不存在统计学意义，见表3.   3  讨论   本研究对四川地区农村结核患者的124株结核分枝杆菌的基因分型和耐药检测分析，结果显示该地区耐药结核分枝杆菌在临床分离菌株中占有一定的比例（25.81%），低于全国2000年结核病流行病学调查结果6，而耐药结核的预防和控制在整个结核病治疗、预防和控制中有着十分重要的意义，尤其是对预防和控制耐多药结核患者的发生尤为重要。表明近几年该地区在结核病，尤其是耐药结核并的预防和控制中取得了显着成绩。   3.1 

17、; 结核病患者的VNTR指纹特征的多态性分析   本次研究采用6个具有代表性的位点进行VNTR基因分型，通过对菌株的等位基因多态性分析，6个位点的等位基因均呈现一定的多态性，各位点的多态性介于0.3090.575之间。这一结果为VNTR基因分型技术中可变数目串联重复序列的筛选和确定提供了重要依据。同时根据检测的6个VNTR位点的重复次数的分析，利用BioNumerics（Version3.0）软件进行聚类分析,124株结核分枝杆菌可分为37个基因型。有32(25.81%)例患者的分离株为单一基因型，可认为是无关分离株，可能具有独立的感染情况或是内源性复燃。其他92(74.1

18、9%)例患者的分离株属于5个VNTR簇之一，提示患者属于各自的群，群内个体间可能存在一定的联系。其中3个簇含15例以上的患者，1个占主导的簇包含56个分离株;另两个簇分别含3个和2个分离株，表明也具有一定的成簇现象。多位点的VNTR提供的遗传信息相对比较保守，还可以根据研究资料把分离株分为不同的菌株家族，如北京家族菌株和 Haarlem 家族菌株等7。本研究采用的是6个串联重复位点的VNTR分型方法，如果能增加样本含量并结合其他分型方法如IS6100，Spoligotyping等技术进行比较研究，就可以使研究结果更加准确和可信。   3.2  VNTR类型与成簇的

19、关系分析   本研究124例患者的临床分离株VNTR分型表明该地区有74.19%(92/124)菌株具有成簇现象，而且统计分析显示成簇菌株的耐药率显着高于单一类型的耐药率。说明成簇结核菌株和耐药菌株存在一定的联系，在耐药结核的预防和控制中值得重点关注。研究还发现涂阳患者成簇性显着高于单一类型，这从一个侧面表明：涂阳患者可能在结核病传播中起重要作用，是当地结核病的重要传染来源。所以，积极治疗和控制涂阳患者，强化DOTS策略，积极开展结核病的防治知识的宣传教育，是从根本上预防和控制结核病的发生、传播和流行的重要方法。   研究中初治结核病患者的成簇率也较高，

20、提示该地区的结核病患者相互间感染而不是复燃在当地结核病发病中占有重要地位；而复治结核病患者成簇率低，可能是由于内源性复燃所致，即治疗失败引起而不是续发所致。   从年龄分布上来看，小于60岁组和60岁以上组在成簇性上存在显着性差异，青壮年患者的分离株成簇率较高，为89.16%（74/83）。提示青壮年患者可能存在相互间传播感染，老年结核病患者可能主要来自复燃。在本研究中，虽然性别差异与成簇性不存在统计学上差异，但是国外多次报道男性是成簇的危险因素，这与国外男性结核病患者多与吸毒或无家可归等特征有关8,9，而这些特征在该地区的结核病患者中并不多见。相反，当地男性结核患者的成簇率低于女性，分别为70.01%（49/69）和78.18