蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法

1、实验九 蛋白质浓度的测定(四考马斯亮蓝染色法 目的要求 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的

2、量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10100µg蛋白质，微量测定法测定范围是110µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，

3、研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。  试剂与器材 一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V乙

4、醇。 二、标准和待测蛋白质溶液1标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2未知蛋白质溶液。 三、器材试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV2000型分光光度计。  操作方法 一、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表a试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.

5、15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm  二、微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表b试管编号0123451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595

6、nm 三、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。  注意事项 （1） （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（2） （2） 测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。  思考题：根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：（1） （