细胞外调节蛋白激酶介导的脂蛋白（a）促血管平滑肌细胞迁移作用

1、细胞外调节蛋白激酶介导的脂蛋白（a）促血管平滑肌细胞迁移作用                        【摘要】 目的： 研究细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在脂蛋白(a)Lp(a)诱导的人血管平滑肌细胞(VSMC)迁移及细胞骨架构建中的作用。方法： 用不同浓度的ERK激酶抑制剂

2、PD98059抑制人VSMC内ERK的活化，再用Lp(a)诱导处理后的细胞，Western blot检测P-ERK的表达，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架构建变化，迁移试验观察VSMC迁移数量的变化。结果： Western blot检测显示PD98059的终浓度在10 mol/L时，P-ERK表达无明显变化（P>0.05），从2040 mol/L，随其终浓度的逐渐升高，P-ERK的表达逐渐降低（P<0.01），达到40 mol/L后，其抑制作用达到高峰。PD98059预处理人VSMC，Lp(a)诱导20 min后，细胞内未见明显的张力纤维、粘着斑及丝状伪足。对照组VSMC迁移细胞数为(

3、78.87±7.43)个，PD98059处理组为(49.20±6.47)个， PD98059处理组较正常对照组明显减少（P<0.01）。结论： Lp(a)诱导的VSMC细胞骨架构建及细胞迁移依赖于ERK的活化。 【关键词】 脂蛋白(A)； 平滑肌细胞； 血管； 蛋白激酶类； 细胞外调节蛋白激酶 Abstract Objective: To study the effect of extracellular regulated protein kinases (ERK) in cytoskeleton reorganization and migration of hu

4、man vascular smooth muscle cells (VSMCs) stimulated by lipoprotein a Lp(a). Methods: The VSMCs treated with different concentrations of ERK kinase inhibitor PD98059 were, then, stimulated by Lp(a) for 20 minutes. The expression of protein ERK (P-ERK ) in VSMCs was detected with Western blotting. The

5、 cytoskeletons of these VSMCs were observed with confocal laser scanning microscope, and the number of cells migrated was determined with migration assays. Results: No change of P-ERK expression was detected in VSMCs when treated by PD98059 with the final concentration of 10 mol/L（P>0.05）. Within

6、 the range of final PD98059 concentrations of 20 mol/L to 40 mol/L, the P-ERK expression in treated VSMCc decreased along with the increasing of the PD98059 concentrations（P<0.01）, and the inhibitory peak was at 40 mol/L of PD98059 group. No filopodia, stress fibers or focal adhesions was found i

7、n DD98059 treated VSMCs.The average number of migrating cells in VSMCs of PD98059 treated groups (49.20±6.47) was smaller than that of control group (78.87±7.43) significantly（P<0.01）. Conclusion: Lp(a) stimulated cytoskeleton reorganization and cell migration in VSMCs is dependent on t

8、he activation of ERK. Key words lipoprotein(a)； smooth muscle cells; blood vessels; protein kinases; extracellular regulated protein kinases 目前已知血浆脂蛋白(a)Lp(a)浓度的升高是各种动脉硬化性疾病的危险因素，Lp(a)不仅与其发病有关，还与其严重程度、术后血管再狭窄及闭塞有很大的相关性。Lp(a)的血浆浓度对生活方式改变和药物的调控不敏感，故目前对Lp(a)致病机制的研究已成为研究的热点。现已发现Lp(a)可促进血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移，

9、但其具体机制仍不明确。用ERK激酶抑制剂PD98059抑制人VSMC内的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活化，探讨ERK在Lp(a)促VSMC迁移中的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 Lp(a)，FITC标记的Phalloidin，鼠抗人平滑肌-肌动蛋白（-actin）单克隆抗体，DAPI购自美国Sigma公司；免疫组织化学染色（SABC）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Costar TranswellTM培养板购自美国Corning公司；兔抗人ERK抗体、兔抗人P-ERK抗体购自美国Cell Signali

10、ng Technology公司；PD98059购自Calbiochem公司。                              1.2 方法 1.2.1 人脐动脉VSMC的原代培养、纯化、传代及鉴定 取剖宫产胎儿的新鲜脐带，分离出脐动脉，剥除脐动脉外膜，刮去内膜，将动脉中膜剪成约1 mm×1 mm&#

11、215;1 mm的组织块进行培养。传代过程中采用差速贴壁法进一步纯化细胞，第510代细胞用于实验1。倒置相差显微镜下观察细胞形态，进行形态学鉴定。SABC法检测VSMC胞浆内的-actin。 1.2.2 抑制剂阻断Lp(a)诱导的ERK活化 1.2.2.1 实验分组 取第510代细胞，用不含或含Lp(a)即为1、2组，Lp(a)终浓度为320 mg/L培养液诱导6 h；用含PD98059（终浓度分别为10、20、30、40及50 mol/L，依次为37组）的培养液预处理1 h后，再用含Lp(a)(终浓度为320 mg/L)培养液诱导6 h。 1.2.2.2 Westernblot印记检测ERK

12、及P-ERK蛋白表达 0.25 %胰酶消化收集上述处理好的细胞后提取总蛋白并用BCA检测法进行蛋白浓度的测定。将蛋白电泳后转膜，用5脱脂奶粉TBST液浸泡过夜，以封闭PVDF膜。按说明书与一抗及二抗结合后行ECL发光检测，对胶片进行扫描，用Totallab软件分析。 1.2.3 抑制剂阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的细胞骨架的标记及观察 实验分2组，分别为对照组及PD98059处理组，向驯化至同一代谢水平的VSMC加入不含或含PD98059（终浓度为40 mol/L）培养液孵育1 h后，予Lp(a)诱导20 min，免疫荧光标记细胞骨架，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架构建。 1.2.4 抑制剂

13、阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的VSMC迁移试验 实验分2组，分别为对照组及PD98059处理组，ERK抑制剂预处理人血管平滑肌细胞后予Lp(a)诱导，Transwell小室检测VSMC迁移。细胞以DAPI染色30 min，每组随机取5个视野，200倍视野免疫荧光显微镜下计数细胞数，取平均值。上述迁移实验重复3次。 1.3 统计学分析 采用SPSS10.0软件对上述结果进行分析，统计数据以均数±标准差来显示，组间比较采用单因素方差分析，两组比较用t检验，P<0.05有统计学意义。 2 结果 2.1 平滑肌细胞的鉴定 倒置相差显微镜观察可见平滑肌细胞呈长梭形，呈现典型的“波峰”

14、与“浪谷”状。免疫组织化学进行平滑肌细胞表型标志物-actin染色，可见细胞胞浆呈棕黄色, 胞核呈淡蓝色，证明培养的细胞是平滑肌细胞。 2.2 抑制剂对Lp(a)诱导的P-ERK蛋白表达的影响 Western blot检测显示各组VSMC内的ERK蛋白表达量之间无明显差异（P>0.05），故以ERK的蛋白表达量作为内参照。第2组较第1组P-ERK/ERK比值明显升高（P<0.01）；除第2组与第3组之间和第6组与第7组之间的P-ERK/ERK比值无明显差异（P>0.05）外，其余36组P-ERK/ERK比值两两之间均有显著性差异（P<0.01）。见图1。 2.3 抑制剂

15、阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的细胞骨架构建状况 PD98059处理组与对照组相比，细胞内未见明显的张力纤维、丝状伪足（图2及图3）以及粘着斑形成（图4及图5）。注：(1)：与前1组相比，P<0.01；(2)：与前1组相比，P>0.05 2.4 抑制剂阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的VSMC迁移 VSMC迁移试验显示，正常对照组VSMC迁移细胞数为（78.87±7.43）个，PD98059处理组为（49.20±6.47）个， PD98059处理组较正常对照组明显减少（P<0.01）。 3 讨论 Lp(a)是1963年由挪威遗传学家Berg2首先从血浆中

16、分离出来并命名的。此后经一系列研究证明人Lp(a)与动脉粥样硬化有关的各类疾病有密切关系，是动脉粥样硬化、动脉再狭窄、卒中、冠心病及心肌梗死发生的一个主要危险因素，并与其它血脂水平无相关性，是一个独立的危险因素3。血液中Lp(a)的浓度是一个稳定的遗传标志，不受性别、年龄、饮食、理化因素及多种降脂药物影响。Lp(a)的致动脉粥样硬化作用机制有以下几个方面：Lp(a)能破坏受体介导的血管内皮舒张功能，导致内皮功能失调；Lp(a)可能通过清道夫受体途径、LDL受体途径及非受体途径等穿过血管内皮，参与泡沫细胞形成；Lp(a)和纯化的Apo(a)可促进VSMC迁移和增值；Lp(a)有促血栓形成作用。一

17、系列研究证实了VSMC从中层向内膜的迁移是动脉粥样硬化和血管再狭窄共同的病理基础4。但Lp(a)促VSMC迁移的机制目前仍不明确。                              细胞骨架是细胞质内由蛋白质组成的三维网架状结构, 分为微管、微丝、中等纤维和微梁网格等，是参与介导细胞变形、细胞运动及细胞迁移等重

18、要活动的蛋白质体系5。该体系由肌动蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白结合蛋白组成。其中肌动蛋白是最丰富的蛋白，是构成微丝的基本成分，故微丝又称为肌动蛋白细胞骨架系统，其基本结构单位是纤维状肌动蛋白(F-actin)。张力纤维及丝状伪足即是显微镜下的F-actin呈现出的形态。本实验中采用免疫荧光标记F-actin来观察这些结构的构建。 ERK包括ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢、血清及佛波酯等外界刺激而激活。ERK1/2是由Boulton等6，7于上世纪90年代初期分离鉴定的，相对分子量分别为44 kD和42 kD，它们有90的同源性。ERK1/2的活化是将

19、信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，ERK1/2信号通路(RasRafMEK1/2ERK1/2)是经典的MAPK信号转导途径，是由1个小GTP蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白组成的级联反应。平时ERK1/2位于胞浆内，一旦被激活，ERK1/2迅速穿过核膜，活化的ERK1/2可磷酸化多种核转录因子如Elk-1、Ets-1、c-Myc、Sapla、Tal、STAT、Fos 、ATF2、Max、c-jun及ATF2等，这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终调节细胞代谢和功能，影响细胞产生特定的生物学效应8。有研究表明，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导

20、的VSMC增殖作用可能与调节G蛋白偶联受体，启动RasRaf MEK1/2ERK1/2通路有关。Yang等9，10等研究发现，Ox-LDL在导致培养VSMC增殖的同时，伴随MAPK的活化，并可诱导ERK1/2的活化，同时ERK1/2的特异阻断剂U0126可完全抑制Ox-LDL诱导的VSMC的增殖。Ox-LDL对ERK1/2活性的影响，提示Ox-LDL诱导VSMC的增殖极有可能是通过活化ERK1/2这一信号通路而实现的。Hu等11研究发现，球囊损伤后早期血管组织ERK1/2活性升高，同时伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高；在损伤后714 d，内膜的ERK1/2仍然升高，并且内膜高于中膜，

21、提示ERK1/2活性和2种癌基因表达的增加可能参与了再狭窄过程。最近Fisher等12观察到了ERK1/2反义寡核苷酸(ODNs)对VSMC增殖和(或)迁移的抑制作用，因而认为在细胞外基质(ECM)所诱导的VSMC迁移和增殖过程中，ERK1/2是发挥了重要作用的关键信号分子。PD98059是MEK的一种药理学抑制剂，PD98059通过选择性抑制MEK1/2的激酶活性，阻止Raf对ERK1/2的磷酸化和激活。 本实验结果显示，各组的总ERK蛋白表达量之间无明显差异（P>0.05），提示Lp(a)是通过ERK的磷酸化而不是使ERK的表达增加来发挥作用的。VSMC经不同浓度的PD98059预处

22、理后，Western blot检测显示PD98059的终浓度在10 mol/L时对ERK激酶无明显抑制作用，从20 mol/L开始，随其终浓度的逐渐升高，其对ERK激酶的抑制作用逐渐增强，但达到40 mol/L后，其抑制作用达到高峰，40 mol/L和50 mol/L对ERK激酶的抑制作用无明显差异，这一结果与Dario等13的发现一致。PD98059的终浓度为40 mol/L时P-ERK的蛋白表达量减少了71.7%，显示了PD98059对Lp(a)诱导的P-ERK蛋白的表达有显著的抑制作用。 激光共聚焦显微镜观察PD98059抑制ERK磷酸化后Lp(a)诱导的细胞骨架构建的变化，显示Lp(a

23、)诱导VSMC 20 min后，细胞内未见明显的张力纤维、丝状伪足以及粘着斑形成。说明P-ERK参与了Lp(a)所诱导的张力纤维、丝状伪足以及粘着斑的形成，MAPK是Lp(a)诱导细胞骨架构建的信号通路中的重要一环。VSMC迁移试验显示抑制ERK的磷酸化可明显抑制Lp(a)所诱导的VSMC迁移。但Lp(a)促VSMC迁移信号通路中的其它具体环节仍有待进一步研究。【参考文献】 1 Shoji M, Sata M, Fukuda D, et al. Temporal and spatial characterization of cellular constituents during neoin

24、timal hyperplasia after vascular injury: Potential contribution of bone-marrow-derived progenitors to arterial remodelingJ. Cardiovasc Pathol, 2004(13):306-312.                        &

25、#160;    2 Berg k. A new serum type system in man: The Lp(a) lipoprotein systemJ. Acta pathol Microbiol Scand, 1963(59):369-382.3 Mary S, Ayrs S, Humphrie S, et al. Lipoprotein(a) as a predictor of myocardial infarction in middle-aged menJ.Am J Med,2001(1):22-27.4 Kaiura TL, Itoh

26、 H, Kubaska SM, et al. The effect of growth factors, cytokines, and extracellular matrix proteins on fibronectin production in human vascular smooth muscle cellsJ. J Vase Surg, 2000(31):577-584.5 Janmey PA. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and me chanical couplingJ. Physio

27、l Rev, 1998(78):763-781.6 Boulton TG, Yancopeulos GD, Gregory JS, et a1. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle controlJ. Sciences, 1990(4964):64-67.7 Boulton TG, Nye SH, Robbins DJ, et a1. ERKs: a family of protein serine/ threo- nine kinases that are a

28、ctivated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGFJ. Cell, 1991(4):663-675.8 Widmann C, Gibosn S, Jarpe MB, et a1. Mitogen-activated protein kinase: con- servation of a three-kinase module from yeast to humanJ. Physiol Rev, 1999(1):143-180.9 Yang CM, Chien CS, Hsial LD, et a1. Mitogenic effect of oxidized low density lipoprotein on vascular smooth muscle cells mediated by activatio