部分古桂遗传多样性的ISSR分析初稿

1、古桂遗传多样性与亲缘关系的ISSR分析段一凡，王贤荣* 作者简介：段一凡（1984-），男，博士，主要从事树木学研究；*通讯作者：王贤荣（1966-），教授，博士生导师，主要从事植物分类学和植物资源学研究，梁丽丽，李雪霞，向其柏，赵正萍(南京林业大学森林资源与环境学院，南京，210037)摘要：利用ISSR分子标记，以云南木犀(Osmanthus yunnanensis和柊树（Osmanthus heterophyllus （G.Don.为对照种，对6个省市45份古桂花和2份野生桂花进行了遗传多样性研究。结果表明：古桂花具有丰富的遗传多样性，选用的14条引物共扩增出148条DNA条带，其中多态

2、性条带131条，占88.51%；平均观察等位基因数、有效等位基因数、Neis遗传多样性指数和Shannon多样性信息指数分别为1.8851、1.4106、0.2415和0.3688；聚类分析结果表明对照种与桂花遗传距离较远，最早分开；古桂花具有很强的地理相关性，来自同一来源地或具有相似颜色的个体往往聚在一起；四季桂与其他秋桂类个体遗传距离较远。关键词：古桂；ISSR；遗传多样性；聚类分析中图分类号：S792.95；TQ920.1Analysis of genetic diversity and relationships among ancient sweet osmanthus trees

3、using ISSR markersDUAN Yi-fan,WANG Xian-rong ,LIANG Li-li,LI Xue-xia,QIANG Qi-bai,ZHAO Zheng-pin（College of Forest Resources and Environment, Nanjing Foresty University,Nanjing,210037)Abstract: Interspecific relationships of 45 ancient sweet osmanthus trees from 6 provinces and 2 wild species of swe

4、et osmanthus were evaluated by using ISSR (inter simple sequence repeat) marker with Osmanthus yunnanensis (Franchet) P.S. Green and Osmanthus fordii Hemsl as contrast species. The results showed that ancient sweet osmanthus trees had abundant genetic diversity. Fourteen ISSR primers produced a tota

5、l of 148 bands, of which 131 were polymorphic. The percentage of polymorphic bands was 88.51%. The mean observed number of alleles, effective number of alleles, Neis genetic distance and Shannon index were 1.8851, 1.4106, 0.2415 and 0.3688 respectively. The cluster analysis showed that the genetic d

6、istance between contrast species and sweet osmanthus was far. Ancient sweet osmanthus trees were closely correlated with geographical locations, and trees from the same place or in similar color often clustered together. The genetic distance between Asiaticus Group and others was far. Key words: anc

7、ient sweet osmanthus trees, ISSR, genetic diversity, cluster analysis桂花Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.属木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus Lour.)植物，为我国十大传统名花之一，在我国已有2500余年的栽培历史1。桂花是长寿树种，在我国很多地方都有树龄超过100年的古桂存在2。中华古桂是中国古老文明的象征，是活的文物标本，也是研究古气候、古环境、古树种质资源以及桂花新品种培育的重要材料，同时还是重要的旅游资源3。桂花遗传多样性研究已多有报道，但研究材料几乎都为新近培育

8、的栽培品种，针对古桂的遗传多样性研究还十分有限，其分子层面研究还未见报道2-15。ISSR（inter simple sequence repeat）即简单重复序列区间，是一种基于PCR扩增的分子标记技术。具有稳定性好、多态性高、实验操作简单快速等特点，而且ISSR标记可以揭示整个基因组的一些特征，不受季节、环境等外在因素的影响。目前已被广泛用于作物遗传育种、植物品种鉴定、基因定位和遗传图谱构建等研究中，是木本植物遗传多样性分析中的主要技术手段之一16-22。本研究以木犀属的云南木犀(Osmanthus yunnanensis和柊树（Osmanthus heterophyllus （G.Don

9、.）为对照种，以来源于全国6个省市45株古桂花和2份野生桂花为研究对象，采用ISSR分子标记对上述实验材料进行了遗传多样性分析，旨在进一步探讨桂花品种群及品种的亲缘关系和遗传演化，为古桂种质资源的有效保护、桂花新品种的培育和遗传改良提供理论依据。1. 材料和方法1.1 材料2009年9月-2011年3月，在全国6个省市共调查了45株古桂（表1），采集古桂的无病虫害的幼嫩叶片装入自封袋中，并装入硅胶干燥，-20度冰箱保存备用。作为对照的云南木犀(Osmanthus yunnanensis以及2份野生桂花采自浙江金华，柊树（Osmanthus heterophyllus （G.Don.材料经专家鉴

10、定，确切可靠。1.2 实验方法DNA提取，采用张博等的CTAB-硅珠法23，稍作改进。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，经紫外分光光度计测定纯度后，最终用TE稀释至约20ng.ul-1。引物根据加拿大British Columbia大学公布的序列设计，参照前人研究11-13，由上海捷瑞（Generay）公司合成。筛选出14条扩增条带较多，背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应。ISSR反应条件经过筛选和优化确定为25L反应体系：DNA模板40ng，10mol/L的引物1.2L，Mix（为混匀好的Taq酶、Mg2+和dNTP，购自上海Generay）12.5L，双蒸水补充至25L。扩增程序

11、为：94预变性5min；94变性1min，50-57复性1min，72延伸1.5，进行40个循环，最后72延伸8min。ISSR-PCR产物在含有溴化乙锭EB（0.5ug/ul）的1.5%琼脂糖上电泳，100V恒压电泳近2个小时，电泳结束于紫外凝胶成像系统拍照。表1 49份实验材料概况Tab.1 Basic information of 49 materials编号No.名称Name树龄age采集地origin编号No.名称Name树龄age采集地origin1四季桂300浙江金华汤溪镇26波叶银桂035180湖北咸宁桂花镇2结籽银桂260浙江金华安地镇27波叶银桂047100湖北咸宁桂花镇3

12、结籽银桂200浙江金华安地镇28波叶银桂023150湖北咸宁桂花镇4金桂600江苏镇江儒里29波叶银桂030180湖北咸宁桂花镇5籽银桂100上海植物园30波叶银桂021500湖北咸宁桂花镇6苏州早黄135苏州博物馆31波叶银桂045100湖北咸宁桂花镇7苏州早黄130苏州南林宾馆33波叶银桂046180湖北咸宁桂花镇8苏州早黄235苏州老防疫站33丹桂300湖北武穴9波叶金桂300苏州南园宾馆34丹桂01200四川成都龙藏寺10波叶金桂170苏州图书馆35丹桂02200四川成都龙藏寺11波叶金桂150苏州博物馆36金桂01300四川成都郫县12波叶金桂150苏州南园宾馆37金桂02300四川

13、成都郫县13金球桂270苏州老防疫站38金桂03300四川成都郫县14金球桂120苏州南林饭店39金桂04300四川成都郫县15金球桂115苏州南林饭店40金桂05300四川成都郫县16银桂300苏州南园宾馆41金桂06300四川成都郫县17波叶银桂043135湖北咸宁桂花镇42银桂07300四川成都郫县18波叶银桂044100湖北咸宁桂花镇43银桂08300四川成都郫县19麸金200湖北咸宁桂花镇44古桂2000陕西汉中圣水寺20江南丽人031200湖北咸宁桂花镇45丹桂1700陕西汉中武侯墓21江南丽人033150湖北咸宁桂花镇46野生桂（银桂）1浙江金华22江南丽人042150湖北咸宁桂

14、花镇47野生桂（银桂）2浙江金华23江南丽人120湖北咸宁桂花镇48云南木犀浙江金华24柳叶桂100湖北咸宁桂花镇49柊树 江苏南京25银星100湖北咸宁桂花镇 注：树龄来自调查时获得的相关信息及各地古树名木志记载1.3 实验数据处理方法ISSR为显性标记，视每条多态性为一个等位基因。根据各分子标记电泳谱带的有无统计所有的二元数据：有带的记为“1”，无带或模糊不清的记为“0”将数据输Excel表格，形成一个二元数据矩阵。根据这个二元数据计算多态位点百分数，采用POPGENE32 ( Version1. 31)，分别计算观察等位基因数（Na）、有效等位基因数(Ne)、Neis遗传多样性指数(H)

15、和Shannon多样性信息指数(I)。采用类平均法(UPGMA)，使用NTSYSpc2.02软件中的SHAN程序对实验材料进行聚类分析。2. 结果与分析2.1 引物筛选和多态性分析参考前人研究，从36条引物中选出14条扩增条带较多，信号强，背景清晰的引物用于ISSR-PCR反应（表2）。表2 14条ISSR引物扩增条带数与多态性比率Tab.2 Number and ratio of polymorphic bands amplified by 14 ISSR primers引物Primer引物序列(53)Sequence(53)扩增带数Amplified bands多态性条带数Polymorp

16、hic bands多态性比率Polymorphic bands rate / %IBC810(GA)8T121191.67UBC811(GA)8C99100UBC813(CT)8T111090.91UBC815(CT)8G10990UBC825(AC)8T121191.67UBC836(AG)8YA1212100UBC841a(GA)8CC88100UBC844(CT)8RC8787.5UBC844b(CT)8GC12975UBC853(TC)8RT7685.71UBC856(AC)8TC121191.67UBC857(AC)8YG10990ISSR12GA(GGA)5G10770ISSR27

17、(TG)8CG151280合计Total14813188.51见图1。由于ISSR揭示的是基因组DNA在酶切位点和其后的选择性碱基的变异，从图1可以看出，同一个体在不同引物产生了不同的ISSR产物图谱，同一引物在不同单株间产生的扩增谱带也不相同，这充分表现了供试古桂花在DNA水平上具有广泛的差异。750bp2000bp500bp250bp1000bp图1 引物UBC857 和 UBC844b 对部分古桂扩增产生的谱带Fig.1 ISSR bands of some ancient sweet osmanthus with primer-UBC857 and primer-UBC844b2.2

18、古桂遗传多样性分析 观察等位基因数（Na）、有效等位基因数(Ne)、Neis遗传多样性指数(H)和Shannon多样性信息指数(I)是衡量遗传多样性水平的常用指标。将各古桂的ISSR扩增谱带用POPGENE32进行分析，结果得出古桂的平均观察等位基因数、有效等位基因数、Neis遗传多样性指数和Shannon2.3 古桂的聚类分析根据49份实验材料的Neis遗传距离，利用UPGMA法进行聚类分析。从聚类图（图2）可以看出，作为对照种的野桂花(Osmanthus yunnanensis和柊树（Osmanthus heterophyllus （G.Don.与桂花遗传距离较远，二者最先分开，45份古桂

19、和2份野生桂花聚为一个大类。从聚类图可以看出，古桂表现出很强的地理相关性，相同地方来源的古桂常常集中聚在一起。如：6-16号来源于苏州的古桂；17-31号来源于湖北咸宁的古桂；34-43号来源于四川成都的古桂分别聚类在一起。四季桂作为一个独特的类群，其分类地位一直引人关注。从聚类图可以看出，作为实验样本中唯一的一个四季桂个体，该样本与其他古桂遗传距离较远。这同前人的研究结论一致，也再次证明四季桂与秋桂类的差异由来已久，且稳定可靠。花色作为桂花品种分类的重要性状一直受到肯定。从聚类图可以看出相同品种、品种群或相似花色的个体常常聚在一起，如：6-8号；26-28号等。产于陕西汉中的两棵“汉桂”(4

20、4和45号)与野生桂花(46号)聚在了一起，这不仅说明了这两棵古桂起源的古老性和近野生性，也为我们了解野生桂花的自然分布和花色演化提供了新的线索。图2 供试材料基于Neis遗传距离的ISSR聚类图Fig. ISSR dendrogram of cluster analysis based on Neis genetic distance for tested materials3. 结论与讨论古桂的珍贵不仅仅是因其“古老性”和丰富的文化背景，还在于它们是经过长期自然选择和人工培育后所形成的独特的、相对稳定的基因资源。由于古桂分布星散，数量稀少，且桂花为雄全异株花，所以其个体间近亲繁殖的可能性很

21、小，因而可以提供比较客观的种质遗传多样性信息。本文应用ISSR分子标记对我国6个省市45株古桂的遗传多样性进行了研究。结果表明：古桂花具有丰富的遗传多样性，选用的14条引物共扩增出148条DNA条带，其中多态性条带131条，占88.51%；平均观察等位基因数、有效等位基因数、Neis遗传多样性指数和Shannon表明古桂花具有很强的地理相关性，这说明在交通并不发达的上百年前桂花跨地区引种的情况比较少，古桂花的引种栽培以小范围、邻近区域的引种为主。而另一方面桂花的遗传多样性又比较丰富，这说明桂花在长期的适应和进化中形成了比较丰富的遗传变异，遗传资源比较丰富。这些珍贵的种质资源对于桂花新品种繁育具

22、有重要价值，因此加强古桂种质资源保护和利用具有重要意义。由于人类活动的不断影响，野生桂花资源越来越难以寻觅，桂花的自然分布区域越来越碎片化。野生桂花作为一种重要的种质资源变得极度稀缺。聚类分析中古汉桂与野生桂花聚在了一起，这说明古桂有很强的近野生性或半野生性，这给我们了解野生桂花分布，研究桂花品种群花色演变，开展野生桂花种质资源搜集保护提供了重要线索。遗传多样性对于物种适应环境变化及进化发展都具有重要意义。根据古桂遗传多样性较高的特点，在对桂花进行开发利用过程中应尽可能地对古桂实施保护，以保护其独特的基因资源，积极开展古桂无性繁育和复壮技术研究，实现种质资源的异地保育和持续利用，使桂花的遗传多

23、样性水平更好的保持和提高。 致谢：感谢南京森林警察学院侦查系谢春平博士、浙江金华华安园林苗木开发有限公司鲍志贤先生、湖北咸宁林科所刘恒贵所长、刘清平高级工程师、王启富干事以及四川成都香王园林有限公司王思明先生在采样过程中所给予的热情帮助，感谢南京林业大学森林资源与环境学院夏涛老师在试验中所给予的热心指导。参考文献：1 向其柏,刘玉莲.中国桂花品种图志M.杭州:浙江科学技术出版社,2008.2 段一凡,王贤荣,梁丽丽,等.我国古桂研究现状及桂花品种起源和演化初探.湖北民族学院学报(自然科学版),2010,28（4）:375-379 3 孙卫邦,向其柏.云南古桂的资源现状及保护利用J.南京林业大学

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