心肌检测标志物_肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究

1、第38卷第2期2006年6月东北师大学报(自然科学版)JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.38No.2June2006文章编号100021832(2006)0220114204心肌检测标志物2,董龙3,钱海刚2,丘瑜敏21.,吉林长春130022;2.长春理工大学生命科学学院,吉林长春130022;3.吉林大学环境科学与资源学院,吉林长春130021)摘要肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明,心血管病人发病早期,心脏中的肌红蛋白会大量释放入血,使其成为检测急性

2、心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术,从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化,后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,得到了纯化的肌红蛋白,并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选,最终得到其特异性亲和配体序列,从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.关键词肌红蛋白;HR100;纯化;肽库筛选中图分类号Q513+.4学科代码1801710文献标识码A0引言肌红蛋白(myoglobin,MB)是肌组织所特有的一种单肽键蛋白质1,主要生物学功能是结合氧并携带氧,是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质,在心肌中含量丰富.心肌蛋白是心肌细胞

3、胞浆蛋白,相对分子质量为17800,它在早期心肌缺血的研究中早有报道2-3.当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高.如心肌梗死发病后412h内,血清中肌红蛋白可达高峰,48h恢复至正常水平4.因此,肌红蛋白成为近年来测定急性心肌梗死(AMI)的一项重要生物学指标.本文对心肌蛋白的分离纯化及配体筛选进行了具体研究,为其试剂盒的研制与应用打下了基础,使其临床诊断成为可能.1材料与方法1.1材料,仪器材料:新鲜猪心(市售).仪器:组织捣碎机,高速离心机,超声波破碎仪,SL-2层析柜,紫外检测仪,记录仪,TH-1000梯收稿日期2005211221基金项目吉林省科技发展

4、计划项目(20030450).作者简介马玉芹(1968-),女,博士研究生,副教授,主要从事环境生物学研究.第2期马玉芹,等:心肌检测标志物肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究115度混合器,凝胶成像仪,电泳装置,超净工作台,干燥箱,高压灭菌锅,移液枪,分析天平,恒温培养箱等.低相对分子质量标准蛋白(购于上海生化试剂所),Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒(购于BioLabs公司),SephacrylHR100柱料(购于鼎国试剂公司),DEAE-52柱料(购于鼎国试剂公司),其他试剂购自鼎国、北京益利试剂公司(均为分析纯).1.2方法1.2.1组织提取物的制备将新鲜猪心与一定量的pH为8.5的10m

5、mol/LTris-HCl3min,然后将匀浆物于高速离心机(10000r/min)中离心,.1.2.2盐析沉淀上清液用1mol/L7.4,10000r/min离心30min,4透析过夜.1.2.3SephacrylHR100柱,控制流动相的流速,收集相对分子质量为1000020000的蛋白质.然后将此蛋白提取液用聚乙二醇(PEG)浓缩,并用pH值为8.5的10mmol/LTris-HCl缓冲液透析过夜.1.2.4DEAE-52柱层析将透析液上DEAE-52柱,然后采用线性梯度法进行洗脱,洗脱液为0300mmol/LNaCl和pH值为8.5的10mmol/LTris-HCl缓冲液.分别收集不同

6、峰值的蛋白组分.1.2.5SDS-PAGE电泳利用SDS-PAGE电泳对上述各步骤、不同峰值获得的样品分别进行鉴定,经与标准蛋白相对照确定肌红蛋白所在的峰,并对其进行收集,冷冻干燥后得纯品肌红蛋白.1.2.6Ph.D-7噬菌体展示肽库筛选筛选步骤按Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒的说明进行.具体为:将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板共同温育,先洗去未结合噬菌体,然后洗脱特异性结合的噬菌体.对洗脱的噬菌体进行扩增,然后再进行下一轮结合/扩增循环,以富集可结合序列.经3轮淘选后,通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性.峰1为高相对分子质量杂质峰;峰2为含肌红蛋白的峰;峰3为低相对分子质量杂质

7、峰.图1SephacrylHR100柱层析过程中样品吸光度变化情况2结果与讨论2.1结果2.1.1SephacrylHR100柱层析过程中洗脱液出峰情况在SephacrylHR100凝胶层析过程中,流出液随时间延长其出峰情况如图1所示.分别收集各峰样品进行电泳.电泳结果表明,肌红蛋白存在于第二个峰中.收集第二峰,走DEAE-52离子交换柱,并收集不同峰值的蛋白组分,电泳结果表明,经离子交换后获得了纯的肌红蛋白(见图2).2.1.2盐析、SephacrylHR100柱层析及DEAE-52柱层析粗提液用80%的硫酸铵盐析沉淀后,离心去上清,对沉淀进行透析,并取样进行电泳,结果见图SD

8、S-PAGE电泳将粗提的样品、经硫酸铵处理的样品、经SephacrylHR100柱层析的样品、经DEAE-52离子交换柱层析的样品进行电泳实验,结果见图2.116东北师大学报(自然科学版)第38卷从图2可知,粗提液中蛋白的种类较多(2泳道),蛋白之间不能很好分辨清楚;盐析样品中蛋白的种类有所减少(泳道3),电泳图谱较清楚;SephacrylHR100凝胶样品中蛋白只剩两种(泳道4,样品未浓缩);经DEAE-52离子交换柱层析后的样品只留下一条带,表明已经纯化得到一种蛋白,且相对分子质量约为1780Ph.D-7噬菌体展示肽库筛选利用Ph.D-7噬菌体展示肽库对心肌蛋白的特异性亲和配

9、体进行了三轮筛选,前两轮为非特异性筛选,第三轮为特异性筛选,结果如下:(1)第一轮洗脱物滴度为6.5×3个/3.74×10-6;(2)5/L,收率为6.96×10-(3)第三轮洗脱物滴度为3.7×106个/L,收率为2.03×10-3.对第三轮洗脱物挑斑测序,得其特异性亲和配体序列为:Arg-His-Pro-His-Leu-Val-Ser.2.2讨论肌红蛋白的相对分子质量约为17800,等电点为6.9.根据其两性蛋白质性质,本实验主要采取了盐析、凝胶层析与离子交换层析三种分离纯化方法.其中盐析法的采用非常必要,粗提液经80%硫酸铵沉淀后,绝大部

10、分杂蛋白会变性,但肌红蛋白的活力没有受到影响.经过此步,部分杂蛋白被除去,样液体积也大大减少,便于后续操作.凝胶层析法主要是根据凝胶的分子筛效应,将相对分子质量大小1标准蛋白;2粗提液;3硫酸铵处理后样品;4SephacrylHR100柱层析后样品(未浓缩);5,6,7DEAE-52柱层析后样品.图2SephacrylHR100柱层析与DEAE-52柱层析电泳结果不同的蛋白质相分离,本实验采用的SephacrylHR100柱料理化性质稳定,且分离效率很高.实验结果表明,采用此柱料分离肌红蛋白效果较好.根据肌红蛋白表面的电荷效应,本实验采用DEAE-52离子交换柱料对其进行进一步纯化,离子交换后

11、的电泳结果表明,利用DEAE-52纯化肌红蛋白是理想的,获得了肌红蛋白纯品.本文利用噬菌体展示肽库技术,以纯化的心肌蛋白为靶分子筛选其特异性亲和配体,三轮收率逐渐提高,第三轮洗脱物测序结果专一性较强,说明利用七肽库筛选结果较理想.3结论肌红蛋白是第一个被确定的具有三级结构的蛋白质,主要生物学功能是结合氧5,是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质.正常人的血液中肌红蛋白含量很少,当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高,故肌红蛋白是用于心肌损伤检测的标志物6.其对急性心肌梗死的检测具有重要的诊断意义.本实验主要是通过SephacrylHR100凝胶层析和DEAE-52离子交换

12、层析对匀浆、离心后的猪心进行分离纯化,每步纯化都经过SDS-PAGE分析,结果证明,经过一系列分离纯化步骤可以得到电泳纯的肌红蛋白.噬菌体展示是一种体外筛选技术.噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning)的体外选择程序得以快速鉴定7.本文以分离纯化的心肌蛋白为靶分子,利用噬菌体展示随机肽库进行了三轮筛选,最终获得专一性较强的亲和配体,这为心肌蛋白试剂盒的临床研制与应用提供了可能.第2期马玉芹,等:心肌检测标志物肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究117参考文献1闵建雄.肌红蛋白及其法医学

13、意义探讨J.法学杂志,1998(5):89-94.2KENTSP.DiffusionofmyoglobininthediagnosisofearlymyocardialischemiaJ.LabInvest,1982,46(3):265-270.3NOMOTOKI,MORIN,SHOJIT,etal.EarlylossofmyocardialmyoglobindetectedimmunohistochemicallyfollowingocclusionofthecoronaryarteryinratsJ.ExpMolPathol,1987,47(3):390-402.4贺兆发,刘云宝,陆春风.

14、,1996,24:392.5孙京新,周光宏.126郑佐娅.,3(3)7activesitesisolatedbyphagedisplayfromalibraryofrandomMol(2122.ThestudyonpurificationandaffinityligandofmyoglobinanewmakerfordetectionofAMIMAYu2qin1,ZHANGShu2hua2,FANLi2ying2,DONGLong3,QIANHai2gang2,QIUYu2min2(1.CollegeofMaterialandChemicalEngineering,ChangchunUnive

15、rsityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;2.SchoolofLifeSciences,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;3.CollegeofEnvironmentandResources,JilinUniversity,Changchun130021,China)Abstract:Myoglobiniscomposedofahemeprostheticgroupandapolypeptidechain(globin)whichhave152

16、residues.Myoglobinexistsmainlyinmyocardium,cardiacmuscleandtheskeletalmuscle.Myoglobincanstoreandassigntheoxygentoalloverthecellandtissueofthecreature.Itisprovedrecentlythatmyo2globincanbeusedasagoodbiologicalmarkerfordetectionofacutemyocardialinfarction(AMI).Inthisthesis,obtainedmyoglobinfrombovineheartmuscleusingSephacrylHR100filtrationchromatographyandDEAE-Sephacelion-exchangechromatography.AfterSDS-PAGEgetthepureproduct.Myoglobinisasensitivemakerwhichcanbeusedindiagnosisofthe