试验程序——姐妹染色单体交换（SCE）试验（C）（二）

1、试验程序姐妹染色单体交换（sce）试验（c）（二） (1)哺乳动物培养细胞（chl)sce测试法 1)仪器设备：细胞培养首先需要有良好的无菌操作间。室内密封性良好，经消毒杀菌后可长时光维持洁净无菌。如无过滤灭菌空气送入式无菌间，用普通无菌室并配有超净工作台也可完成工作。 恒温培养箱：用法co2孵育箱比较抱负，保持5%co2浓度可维持培养液稳定的ph值；如条件不允许，用一般隔水式恒温箱也可满足要求，温度维持在37±0.5，将培养瓶塞塞紧，可维持细胞培养所需的ph值。 电热干燥箱：用于烘干玻璃器皿和干热消毒。干热消毒温度要求达160,2h以上。 超净工作台：最好挑选双侧可操作式、空间较大

2、型的，便于双人对坐操作。 冰箱：一般冰箱，供常常用法的试剂、药品、培养液等冷藏用；-20低温冰箱，供批量储藏血清、试剂、培养液等用。 天平：一般天平、分析天平、电子分析天平等，供称量药物、试剂等用。 显微镜：一般光学显微镜、倒置显微镜、照相显微镜等。前两者必备。 离心机：一般离心机，用于细胞悬液离心，最大转速4000r/min即可；小型台式离心机，供细胞复苏时离心用；高速离心机，制备s9用。 高压消毒锅：小型手提式加热式。供各种不适于干热消毒的制品消毒用，如橡胶制品、塑料制品、针头和试剂等。 水纯扮装置：可按照各试验室用法水量大小而采购不同型号的纯化水装置。试验用水多用双蒸以上的蒸馏水。 抽滤

3、装置：用于不能加热消毒的培养液、试剂和小牛血清等除菌时用。玻璃细菌滤器，普通用g6漏斗抽滤。此滤器清洗、消毒、灭菌等操作较棘手。目前用法金属滤器较多，可选用不同孔径滤膜加压过滤。滤器的清洗消毒较便利。滤膜为一次性用品。 酸度计：用于测定各种溶液的ph值。 电磁加热搅拌器：配制难溶试剂时加温、搅拌用。 超声波洗涤机：洗涤器皿用。 水浴锅：用于小牛血清灭活和染片等。 紫外灯或黑光灯：30w紫外灯，或两个20w黑光灯，供sce染片时用。 co2钢瓶：供给co2孵育箱用。 加样器：5、2、1、0.5、0.2、0.1m1等，用于加受试物、消化液、青霉素、链霉素等用。 2）器材：细胞培养需用大量器材，品种

4、与数量都要充分。按正在用法、正在清洗、已清洗好备消毒、已消毒好备用等举行分类管理。玻璃制品的质量要求严格。除厚薄匀称、透亮度好外，还要求是中性玻璃，尤其培养瓶质量要求很高，否则细胞不贴壁生长。 试剂瓶：500、250、100、50、l0ml等各若干个。输液瓶亦可用于储藏试剂，因其有刻度，瓶塞紧，很好用。 培养瓶：普通常用25m1玻璃制品，也可用培养皿和培养板。 容量瓶：1000、500、250、100、50m1等，供配试剂用。 量筒：500、250、100、50、20ml等，配试剂用。 烧杯：500、250、100、50ml等。 离心管：l0ml刻度离心管，需用量较多。 三角瓶：250、100

5、、50m1等，配养分液用。 吸管：10、5、2、lml等，移液用，需用量多。 滴管：无刻度，移液和吹打混悬液体用，需用量多。 金属盒（饭盒）：分装培养瓶、小试剂瓶、针头、滴管、胶塞等物品消毒、染色时用。 其他抽滤装置，g5、g6砂芯漏斗，注射器，冻存管，酒精灯，吸头，橡皮吸球，试管架，橡皮塞，凉片架，凉片板，血球计数板，滤膜，滤纸，ph试纸，记号笔，平皿，工作服，口罩，帽子，拖鞋等。 3)试剂配制： 培养液：目前对化学物质和环境污染物遗传毒性监测，最常用的细胞株有chl、cho、v79等，此类细胞用eagle、mem、rpmi-1640和f-12等培养基均可得惬意结果，可按各培养基解释书配制。

6、现介绍用rpmi-1640(sigma公司出品）配制办法。rpmi-1640(sigma公司出品）纸袋封装，每袋10.4g，加hepes3g，加nahco32g，溶于l000ml二次蒸馏水中，或按比例缩减，无菌过滤，分装于2-3个试剂瓶中，密封，置-20冰箱保存，可用半年。用时取出存4冰箱，可用2周。全培养液配制比例：rpmi-16409份，小牛血清1份，青霉素100单位/ml培养液，链霉素l00g/ml培养液，调ph值7.0-7.2即可。人淋巴细胞培养时，需加入肝素、植物凝集素（pha)。 消化液： a.0.25%胰蛋白酶：称取活性为1：250的胰蛋白酶粉剂0.25g，另预备d-hanks工

7、作液l00ml。先用半量d-hanks工作液于烧杯，在控温磁力搅拌器上搅拌约1-2h使溶解，温度不超过36。再将剩余的d-hanks工作液所有加入，用nahco3调ph值至7.2，然后，除菌过滤，分装于青霉素小瓶中，密封，置-20冰箱保存。 b.0.5胰酶-0.02%edta平衡盐溶液：称lg活性为1：250胰酶，溶于200ml无菌的0.02%edta平衡盐溶液，在室温下溶解4h或4过夜，用5%nahco3调ph值至7.2,分装于青霉素小瓶，-20冻存。 d-hanks液：d-hanks原液，分离称取nacl80.0g,na2hpo4 2h2o0.6g,kh2po40.6g,nahco33.5

8、g，加二次蒸馏水溶解至l000ml。配制时要注重按挨次逐一加入上述试剂，应等前一种试剂彻低溶解后再加下一种试剂。原液配好后分装于500m1或250ml试剂瓶中，8pd/in2*15min高压灭菌，冷后置一般冰箱保存。用时取d-hanks原液l00ml，加三次蒸馏水896ml，再加0.5的酚红液4m1,混匀即成，存4冰箱。 0.02%edta平衡盐溶液：称edta0.2g,nacl8.0g,kc10.2g,na2hpo4 12h2o2.89g,kh2po40.2g,葡萄糖0.2g溶于l000ml二次蒸馏水中，高压灭菌，用nahco3调ph值为7.2。 0.5%溶液：称0.5g酚红粉，置干燥研钵中

9、研磨匀称，边磨边加入0.lmol/lnaoh12ml，使之彻低溶解，然后加二次蒸馏水至100ml,4冰箱保存。 细胞冻存液：在含20%-30小牛血清的1640培养液中，加入二甲亚砜，使其终浓度为10%（或加入丙三醇并使终浓度为5%)。 抗菌素： a：取80万单位青霉素一瓶，注入8m1生理盐水，分装于灭菌小塑料带盖离心管中，-20冰箱保存。 b：取100万单位链霉素一瓶，注入l0ml生理盐水，分装于灭菌小塑料带盖离心管中，-20冰箱保存。 小牛血清或胎牛血清：是细胞培养时必不行少的养分物和刺激因子，选购时需挑选新奇出品，外观清亮、微黄，用前须置56水浴，30min灭活。无菌过滤（血清质量很好时，

10、可免除），然后分装于青霉素小瓶（避开反复冻融，影响血清质量）密封，置-20冰箱保存。 s-9混合液：s-91m1,nadp（氧化型辅酶ii）33.8mg,g-6-p-na(6磷酸葡萄糖）14.1mg,1.65mol/lkcl和0.4mol/lmgcl2混合液0.2m1,0.2mol/l磷酸缓冲液5m1,无菌二次蒸馏水3.8m1,混合得l0mls-9混合液。现用现配，其加量不得超过培养液的10%。 碳酸氢钠溶液：用于调ph值，可配10%,5%溶液，用二次蒸馏水溶解，高压灭菌，8pdl/in215min，密封存于4冰箱，用过后再用时必需重新灭菌，或买市售安瓶装品。 秋水仙碱：一种抑制纺锤体的生物碱

11、，起到堆积更多染色体中期分裂相的作用，通常培养液中含0.2g/ml即可达很好效果。秋水仙碱毒性剧烈，可长久保存。称l0mg秋水仙碱溶于100m1灭菌生理盐水，得0.01浓缩液。4冰箱避光保存（最好用黑纸包好瓶子）。用时再按1：10稀释。 低渗液：低渗处理为使细胞膨账，核膜破碎，染色体适度簇拥而易观看。普通用0.075molkcl溶液。称5.598kc1,溶于1000m1蒸馏水中。室温保存。 细胞固定液：起固定细胞表面，防止细胞粘连成团作用。常用甲醇和冰乙酸混合液，按3：1比例配制。需现用现配，配好的液体不应超过1h，由于混合液易挥发，影响固定效果。 5-溴脱氧尿苷(brdu)溶液：用无菌青霉素

12、小瓶称brdu4mg，加入无菌生理盐水4m1，用黑纸包瓶（避光），置4冰箱保存。 2×ssc液：称17.538nacl,8.828柠檬酸钠（na3c6h7 2ho2)，溶于1000ml蒸馏水中。 hoechst-33258液。 （pbs): a称取9.478na2hpo4溶于1000m1蒸馏水。 b称9.088kh2po4溶于1000m1蒸馏水。按照不同的ph值需要，用时a、b液按不同比例配制。 giemsa染液：取giemsa染料lg，放研钵中，加甘油少许研磨，边研边加甘油，共加66ml，置60温箱中保温90min，冷却后加66m甲醇（也可按比例一次多配，供长久用法），混匀后于室温

13、静置1-2周，过滤，用棕色瓶储藏备用。临用时磷酸缓冲液稀释至所需浓度。 4)染毒：环境水样或化学污染物举行sce监测实验之前，须经过样品处理，使成为固体样品。然后，需确定是否为水溶性的。如是水溶性的物质，可用灭菌生理盐水溶解；如是非水溶性物质，可用灭菌二甲亚讽(dmso)溶解。受试物在培养基中的浓度最高不得超过5mg/ml。受试物浓度普通以能抑制50的细胞生长浓度为最高浓度；或以抑制细胞有丝分裂指数减低50为指标，因抑制有丝分裂也是物质毒性的一种表现。然后以倍比稀释法或数量级递减稀释。确定受试物最高浓度，应多设几个剂量组，作细胞存活曲线，求出细胞存活一半时受试物的浓度，以免需多次试验确定。确定

14、染毒剂量办法： a以细胞生长克隆数作细胞存活曲线求ic50。先用培养基稀释细胞悬液为1000个/ml左右，每培养瓶加0.5m1细胞悬液，再加2.4ml培养基，混匀后置37恒温箱培养，至细胞贴壁后染毒。将稀释好的受试物每瓶加0.1m1，应设7-10个浓度组，笼罩三个数量级，每个浓度组设三个平行样，染毒24h，去掉培养液，再换新奇培养液3ml，继续培养4-7d,使形成克隆。去掉培养液，加甲醇0.5ml固定10-15min,giemsa染色，数克隆数。以空白对比克隆数为100%，各剂量组克隆数除以空白组克隆数，得各剂量组克隆百分数。纵坐标为各剂量组克隆百分数，横坐标为受试物浓度，绘制细胞存活曲线，求

15、出ic50的浓度。 b活细胞计数法求ic50。预备好接种细胞数全都、每瓶含培养液2.9ml、已培养到细胞指数生长久的培养瓶若干瓶，加入已溶解好的不同浓度的受试物0.lml,混匀后置37恒温箱培养。每种浓度需三个平行样，并设空白对比。继续培养24h。倾去所有培养液，消化瓶壁细胞，加入定量培养液稀释并混匀为细胞悬液。取部分细胞悬液，一按9:1比例加入0.4台酚蓝染液。静置2-3min，取细胞悬液滴在血球计数板盖玻片边缘，使液体弥漫计数板，但不能有气泡或过多液体使盖片飘荡。如操作不胜利，可以重做。然后在显微镜下计四个角大方格中的活细胞数。活细胞不着色。如有压线细胞，计右侧和上线的，不计左侧和下线的。

16、每个样品应重复计数一次，取平均值。细胞计数公式： 细胞数ml=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数 分离求出每种浓度活存细胞数后，在半对数坐标纸上作图。以活存细胞数作纵坐标，受试物浓度作横坐标，绘出细胞存活曲线，求出受试物半数抑制浓度。以ic50为最高剂量组，中剂量组可以倍数关系递减，使结果呈一定剂量关系为原则。 5）试验步骤：染毒剂量确定后，可举行正式试验。先设计分组，要设对比组（空白对比、溶剂对比、阳性对比等），试验组数按照试验目的设置。每组起码设两个平行样。将繁殖有足够数量、处于指数分裂期、贴壁生长良好的的chl细胞，消化后用全培养液制成匀称全都的细胞悬液，每瓶加入量

17、按照稀释细胞数而定，每瓶约5×105个/ml或1×106个/ml等量的细胞悬液，然后加入全培养基使总量为3.0m1。置37恒温箱培养，约24-48h,观看细胞贴壁呈指数生长久。换不含血清的培养液每瓶2.9ml，加入配制好的不同浓度的受检物、阴性、阳性对比物，使25ml培养瓶中培养液总量为3.0ml,混匀，置恒温箱培养染毒1-2h；加活化剂s9时，换不含血清的培养液每瓶2.6ml，加入配制好的不同浓度的受试物、阴性、阳性对比物各.lml，加配置好的s9活化剂0.3ml，使25ml培养瓶中培养液总量为3.0m1,混匀，置恒温箱培养染毒1-2h。去除含受试物的培养液，用hanks

18、液洗一遍细胞后，加入含brdu(10g/ml培养液）的彻低培养液避光培养。如用一般温箱，则将瓶塞塞紧，如用co2孵育箱则瓶盖要松，以使co2能调整培养液的ph值。继续培养两个细胞周期（24-28h,chl细胞周期为12-14h)。在终止培养前2h，按0.02g/ml（培养液）加入秋水仙碱，终止培养时倒掉培养液，消化收获细胞，制片。 染色体片制备： 将培养到期的培养基所有倒入事先已编号的离心管中，向每瓶细胞中加入消化液0.5m1，放置2-3min（视室温而定时光长短），使细胞所有脱落。再用原培养液将细胞转入离心管，并轻轻将细胞打成混悬液。以1000r/min离心5min，弃去培养液。每管加0.0

19、75mol/lkcl低渗液5m1，置37温箱15min。缓慢加入lml新配置好的固定液（甲醇二冰乙酸3：1)，轻轻混匀。以1000r/min离心5min。弃去上清液，加固定液4m1混匀，固定20min。以1000r/min离心5min，起码固定二次，弃去上清液。加0.1-0.2m1新固定液，充分混匀制成清亮的细胞悬液。滴2-4滴于清洁、冰冻的玻片上，置凉片板上空气干燥。每一样品需制2-3片。 6）分化染色：在细胞的dna合成过程中，brdu能作为核普酸前体物替代胸腺嘧啶核苷mr)掺入到新合成的核苷酸链中。所以，当细胞在含有brdu的培养液中经受第一次分裂时，形成的中期染色体中两条姐妹染色单体的

20、dna双链的化学组成就产生了差别。其中一条dna链中的tdr的位置被brdu代替，而另一条dna链中的tdr未被代替。此时，当用giemsa染色时，两条染色体着色程度全都都被深染。而当细胞经受了两个细胞周期之后，中期染色体的dna双链在化学组成上有了进一步的差别，其中一条染色单体的双链中都含有brdu；而另一条单体中，仅有一条链含有brdu。双股dna链都含有brdu的染色单体，当用热盐溶液处理或受到光的照耀后易被水解，降低了与荧光染料或giemsa染料的亲和力，从而着色浅，造成了两条染色单体染色深浅的不同。sce分化染色法可采纳以下几种： a.hoechst33258黑光灯法：将老化3-7d的染色体标本依次浸入0.14mol/lnacl,0.004mol/lkcl和0.01mol/l磷酸缓冲液（ph7.0)中各5min。浸入用0.0lmol/l磷酸缓冲液配制