BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程

1、BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目 的：规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人 身安全和设备安全。适用范围：本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。责任者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。内 容：1 .每日开机程序1.1 在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1 鞘液充满状态，约 3L1.1.2 盖紧盖子1.1.3 安上金属挡板1.1.4 管

2、路畅通，无扭曲1.2 .检查废液桶，确认：1.2.1 废液桶充满400ml漂白剂1.2.2 管路畅通，无扭曲1.3 打开流式细胞仪。1.4 打开电脑。1.5 气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。1.6 做 Prime。1.7 等待机器预热510分钟后可开始试验。2 .每日关机程序2.1 用3mlFACSClean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。2.2 将样品支撑架置于中位，以 HI RUN运行10分钟，使内管吸入 约1ml。2.3 将样品管换成蒸储水重复1-2步。2.4 放置盛有1ml蒸储水的试管于样品支撑架上。2.5 选才i Standby模式10分钟，将激

3、光冷却后可关掉主机。2.6 退出所有应用软件，关闭电脑。2.7 将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。3 .每月维护程序3.1 将FACSClean洗?12L装入鞘液桶。3.2 旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联 至ij SANLINE FILTER端口）,以防伤害。3.3 将盛有 3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。3.4 将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以 HI RUN 60 分钟。3.5 将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。3.6 以 HI RUN 10-20 分钟。3.7 在测定正式样品之

4、前实施每日开机程序。4 . FACScomp 自动质控操作4.1 试剂准备4.1.1 三色试剂的校正（Cat No： 340486）4.1.1.1 取四色试剂盒中的Unlabeled 试剂，充分混匀，加一滴到装有1ml 鞘液的试管中，混匀，标记为 unlabeled 。4.1.1.2 取 FITC、 PE、 PerCP、 unlabeled 试剂，充分混匀，各加一滴到第二支装有2ml 的鞘液的试管中，混匀，标记为mixed。4.1.1.3 上机进行仪器的校准。4.1.2 或四色试剂的校正（Cat No： 340486； Cat No:340487 ）4.1.2.1 取试剂盒中的unlabele

5、d试齐U和APC试齐U各一滴力口入至U第一支装有1ml鞘液的试管中，混匀。4.1.2.2 取 5 种试剂（FITC、 PE、 PerCP、 APC、 Unlabeled ）各一滴加入第二支装有2ml 鞘液的试管中，混匀。4.1.2.3 上级进行仪器的校准。4.2 Calibrite beads FACScomp 上机操作的具体步骤4.2.1 执行 FACSalibur 开机程序；4.2.2 执行 FACScom歆件；4.2.3 在运行“ Sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“Acceppt ”；4.2.4 进入"Set Up窗口

6、，先看最左侧的 Assay selection 选项，在里面选中 Lyse/Wash或Lyse/No Wash；4.2.5 在 Calibrite Beads Lot IDS 中，根据每种颜色的beads 所对应的Lot ids ，输入编号，次编号在 Calibrite Beads 试剂盒内，打开新买的试剂盒，里面有一张橙色胶纸，取出贴在试剂盒的背面，标题是 Calibrite BeadsTM3Batch NO,选择 FACS Flow Sheath 下的编号（右侧的编号）；如做四色校正，同样方法输入Calibrite BeadsTM APC的IDS。4.2.6 在右侧的保存选项中文件会自动保

7、存，路径 FacstationBD fileFACSCompDDMMYY,还可以单 击“ Location ”改变保存路径；4.2.7 其他的不要改动，直接单击“ run”出现PMT1窗，然后准备好上样管；4.2.8 上第一管后单击 start ,仪器开始自动调节PMT完成后仪器会在窗口底部出现一行提示：“ PMTs set Successfully ”，这时软件会暂停 5 秒，然后自动进入下一个调节窗口（Comp 窗口 ） ；如果是四色微球调试，仪器还会对激光的延迟进行测试，直到仪器电脑屏幕出现提示: “ Time DelayCalibration was successful ,然后才会同

8、样自动进入下一个调节窗口（Comp0 口）；4.2.9 上第二管，单击start ，仪器开始自动调节补偿并进行灵敏度测试。完成后仪器会给出提示，最后软件给出一个 Summary Report。检查报告中的“ Result ”是否都 PASS如果有没有 PASS坚持原因。 （ 1 ）是否试剂过期（2）两个试管中的液体和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）日常维护是否充分适当（5）联系BD人员4.2.10 打印报告，退出 FACScom献件；4.2.11 计算机会自动把 FACScompB式结果保存在 Calib File或Calib File .LNW （免洗试验）中，运行其他程序，调用这

9、些结果就可以进行样本的检测。注意事项：1 、第一管的速率不能低于400 个 / 秒（ run high ） ，少于时可以补一滴Unlabeled 。2 、两个试管中的鞘液必须和鞘液桶中的是同一种液体。5 .FACScomp校正HLA-B27的操作说明5.1 试剂的准备：取 HLA-B27 试剂盒的 HLA-B27 calibration beads （Cat No : 340183）试剂，混匀，加两滴到装有 1ml 鞘液的试管中，混匀，待测。5.2 FACScomp 上机检测HLA-B27 的具体步骤5.2.1 执行FACSCalibur 开机程序；5.2.2 运行 FACScom歆件；5.2

10、.3 在出现“Sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“Accept”；5.2.4 进入“ Set up ”窗口，先看最左侧的 Assay selection 选项，选择HLA-B27 Assay ，在进行HLA-B27 Assay 之前，必须一次性的通过Lyse/Wash Assay 校正；5.2.5 在右侧框中输入正确的HLA-B27 Lot No 值、 Suffix 值和 Beads Lot No 值。这些参数分别决定了 FL1 PMT的标准和decision maker的位置。对于结果至关重要，不可弄错；5.2.6 在右侧的保存选项中

11、文件会自动保存，路径日期，还可以单击“Location ”改变文件保存路径；其他的不需要改动，直接单击“ run”出现PMTW窗，然后准备好上样；5.2.7 放上 Beads 管后单击start ， 仪器开始自动调节PMT。 完成后仪器会在底部出现一行提示：“ PMTsset successfully ”这时软件会暂停 5 秒，调试后的结果会自动保存在Calib File.B27 中，并生成summary Report ；5.2.8 退出FACScom歆件，然后进入 HLA-B27软件进行检测。6 .MultiSET 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数6.1 实验原理：用已知总数的荧光微球Bead

12、s 做标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3 CD4 CD& B、NK细胞的绝对数。细胞（/ul ）=（细胞获取数x Beads总量）/ （Beads获取数样本量）6.2 主要试剂：6.2.1 抗体：CD3/CD8/CD45/CD4 CD3/CD16+56/CD45/CD19四色荧光抗体。6.2.2 Trucount 管（内含数量已知的Beads） 。6.2.3 FACS Lysing Solution （溶血素）（10X ,使用前用蒸储水稀释成1X）6.3 实验步骤:6.3.1 取2支TruCount管，顺序编号 A和B;6.3.2

13、 用反向加样法在Tube 中加入 50ul 充分混匀的抗凝全血; 注意 : 血不要碰到试管底部的微球（Beads） 。6.3.3 取 20U1CD3/CD8/CD45/CD4 抗体力口入至U A管中；取 20U1CD3/CD16+56/CD45/CD19 抗体加入到 B管中。注意：不要碰到血。涡旋混匀，室温避光放置15-20min ；6.3.4 加入450ul 1 XFAC的血素，充分混匀，室温避光放置15min；6.3.5 24 小时内上机，用MultiSET 软件获取15000 个细胞进行检测，上机前应充分混匀。6.4 注意事项：6.4.1 样本使用EDTA抗凝全血，室温放置，24小时内处

14、理，处理前充分混匀。6.4.2 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二挡，放时打到第一档，保证血量 的准确，减少误差。6.4.3 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀，过程中尽量防止血样的飞溅，以免血样留 在管壁上。6.4.4 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。6.4.5 TruCOUNT管2-25C保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNTf包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNTt应弃去不要7 MultiSET 软件收获分析的具体操作7.1 执行 FACSCalibur 开机程序，进入MuliTSET 软

15、件。7.2 在出现 “ sign in ” 窗口中输入操作者姓名、单位、 负责人姓名等信息，计算机将保存这些信息；相关信息，单机“Accept ”。7.3 进入“ set up ”窗口：7.3.1 在“ Data Source ”对话框中选择“From Cytometer ： Acquisition and Analysis ”；7.3.2 在“ Automatic Saving Options ”中选者“Data File ”、 “ laboratory Report ”、 “ PhysicianReport ”， 软甲会自动生成并保存报告文件，文件的默认路径FaacstationBD fi

16、leMultisetDDYYMM文件夹；7.4 在“ View Report ”中选择“Until Next Button Pressed ” .7.5 然后单击“ Accept”，进入“ FACSComp窗口，单击“ skip FACSComp （四色仪器调整 FACSComp 在检测前单独完成，见FACSCom操作部分）。7.6 进入“ Test Prefs ”窗口，在“Physicians Report Choices ”一项可以全选，运行一种试剂，会自动报告相应的结果。在“Lot ID ”中输入 TruCount 管批号和Beads 总数（标在包装袋上），单击“Accept ” 。7.

17、7 进入“Samples”窗口，在表格中输入相应的Patient Name、IDCase Number和在Panel中选择 4color TBNK+Truc ；7.8 在窗口最上方“Cytometer ”的下拉菜单中依次选择“Detectors/Amps ” 、 “ Threshold ” 、“ Compensation ”、“ Staus ”， 出现相应的四个窗口；在 “ Cytometer ” 的下拉菜单中，单击 “ InstrumentSetting ” ，在出现的新对话框中单击“open ” ；打开路径下FacstationBD fileInstrumentSettingCalibur

18、.LNW 文件，调用仪器各个参数条件，最后单击“Open” “ Set ”“ Done”。7.9 单击“ Run Test "，上样，此时调整 SSC电压和阈值，单击“ Acquire7.10 获取完成后，可以打开屏幕底部的“ Manual Gate” 人工调整各个门的大小，单击 “ Continue ”，进入医生报告窗口“Phys Report ”，可打印。7.11 继续其他实验，或单击“Quit ” , “ Don t Save ” , 退出 MultiTest 软件。操作中特别注意第3-7 步，尤其是第7 步。注意： 做相对计数时，用普通的流式管代替TruCount 管，在 P

19、anel 中选择 4colorTBNK 。做三色绝对或相对计数时，只需改变Panel 即可。8 CellQuest Pro 双色淋巴细胞亚群分析样本制备8.1 实验目的：使用双色组合标记抗体对人外周血中淋巴细胞亚群进行检测，了解认得免疫状态。从而指导临床诊断和治疗。8.2 实验原理：利用荧光技术，在不同的鼠抗人的抗体上标记荧光素，此荧光抗体就同人淋巴细胞表面是CD分子特异性的结合；然后用流式细胞仪检测，结合分析软件的自动分析，便可以得出各亚群细胞的百分比。8.3 主要试剂：8.3.1 流式细胞仪（FACSCalibur）,台式离心机，涡旋振荡器，微量移液器（1000 L、200科L、20L,流

20、失细胞专业试管、鞘液； PBS （力口 0.1%叠氮钠）；8.3.2 双色检测试剂： Isotype Control （ MouseIgGi/IgG 2a）CD3-FITC/CD19-PE CD3-FITC/CD4-PE CD3FITC/CD8-PE CD3-FITC/CD16+CD56-PE8.3.3 FACS Lysing Solution红细胞裂解液（10 x ,使用前用蒸储水稀释成1 X ）。8.3.4 1% 的多聚甲醛，配制方法:称1.0克多聚甲醛加少量 PBS放入56c水浴箱中使之溶解，用 1N NaOHm和1N的HCL调整PH值 在6.9-7.0，然后加入100ml容量瓶中定容，

21、最后用0.45 m的滤膜过滤。8.4 实验步骤：8.4.1 取5支流式试管，编号为 1、2、3、4、5,分别取10 dL抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。8.4.2 轻轻混匀，依次力口入20 dL 双标 Isotype Control（ MouseIgG1/IgG 2a）、CD3/CD19 CD3/CD4CD3/CD8 CD3/CD16+CD5凌光抗体。室温避光保存20分钟。8.4.3 取出试管，每管加入10倍稀释的1XFACS Lysing Solution 2ml ,涡旋混匀，避光 10分钟。300g离心5min ,弃去上清液。8.4.4 每管加入2ml 的 PBS， 涡旋混匀，3

22、00g 离心 5min， 弃去上清液。然后加入0.5mlPBS 混匀，4避光 1h 内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml 1% 多聚甲醛，放4冰箱保存，48h 内上检测。9 .CELLQuest Pro 的简要操作步骤（1）Acquisition 获取数据9.1 打开获取模板（ACQt件），如无现成的模板则制作新模板：9.1.1 选择点图或直方图工具，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形的边缘9.1.2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口选择：9.1.2.1 Plot Type 点图类型：如Acquisition 获取9.1.2.2 X Parame

23、ter 横轴参数：如FSC;Y Parameter 纵轴参数：如SSC9.1.2.3 Gate 设门：如No Gate 或 G1=R19.1.3 图形设置完毕，选择SAVE AS,保存为ACQ文件9.2 联机 Acquire fConnect to cytometer ，出现 Acquisition control 和 Browser 窗口，先斗B Browser窗口最小化；9.3 数据获取前的设定：9.3.1 Acquire fAcquisition& Storage-设定获取细胞数（10000-ALL） -OK9.3.2 打开最小化的-Browser 对话框选择：-Director

24、y :单机Change设定存储数据文件的文件夹；-File 设定数据文件的名字：文件前缀 （ Prefix ） -自定义； 文件后缀 （ Suefix ） -管号 （设为 1） ，单机 ok；- 检测或设置panel ，确定试验组合；如果没有相应的 panel则设置新的panel : Acquire fEdit panel ,在弹出的对话框单击add选项，在 new panel 中输入新的panel 名称，然后单击前面的三角选中该panel 激活 Tubes 窗口，单击add加试验管，编辑各试验管的P1, P2, P3, P4确定实验组合，单击 ok;然后按照已有 panel操作；已有 pan

25、el 的在 Untitled Acquire Tube List下来菜单中选择 Load Tubes From Panel f选择新编辑或实验对应的panel9.3.3 Acquire fCounter 打开计算器。9.4 打开获取条件窗口，调出实验获取条件（Instrument Setting ）9.4.1 Cytometer-Detectors/Voltage ， Threshold ， Compensation9.4.2 Cytometer-Instrument Setting-Open 打开实验获取条件（FACSStation-BD File- InstrumentSetting Fi

26、les-Calib file 或者 Calib file.LNW ） Open-set-done9.4.3 实验获取条件的调整：Acquisition Control-"Setup-上样（第一管）-Acquire-进行实验获取条件的调整：FSC SSC电压。FSC阈值（Threshold ）：减少碎片。设门：FSC/SSC点图设门（R1）;荧光（FL）点图（如FL1/FL2）或直方图（如 FL1）取门G1=R1（点 击图形的边缘-Inspector-Gate ： G1=R1）。阴性对照管，调整荧光电压（ FL1、FL2、FL3、FL4Voltage ）,使阴性群体在左下角，确定十字位

27、 置。换地 2 管，多色实验的补偿管（单阳性），调整荧光间补偿（Compensation ） ：（ 1 ） Cytometer-Instrument Setting-Save 保存实验获取条件（InstrSet+ 实验获取名称）-Done （此步骤为可选项）；File-Save保存卞II板ACQt件（新作模板）。（ 2） Acquisition-Counter ，打开计数器。9.5 顺序上样，获取数据文件：Acquisition Control- Setup- 上样 -Acquire- 仪器获取足够细胞后，自动保存数据文件（data file ） ， Quit- Don t save10.CE

28、LLQuest Pro 的简要操作步骤（2）10.1 Analysis 数据分析（新作模板ANA文件）10.1.1 做FSC/SSC点图，圈细胞 R110.1.1.1 选择点图工具，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形边缘10.1.1.2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口选择：Analysis 分析； Select File 选择第一管数据文件；X Parameter 横轴参数-FSC;Y Parameter 纵轴参数-SSC； Gate 设门 -No Gate10.1.1.3 选择设门工具-在FSC-SSC岚图上，圈细胞 R1 10.1.2 做阴性对照

29、管门内细胞的FL1/FL2 点图，设十字，区分阴性和阳性界限1.1.1.1 1 选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形边缘1.1.1.2 2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口选择：Analysis 分析； Select File 选择阴性对照管数据文件；X Parameter 横轴参数-FL1;Y Parameter 纵轴参数-FL2 ； Gate 设门 -G1=R11.1.1.3 3 选择十字工具-在阴性对照管FL1/FL2 点图上，沿阴性群体设十字10.1.3 做各实验管门内细胞的FL1/FL2 点图，拷贝阴性对照管的十字10.1.3.1 选

30、择点图，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形边缘10.1.3.2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口选择：Analysis 分析； Select File 选择实验管数据文件；X Parameter 横轴参数-FL1;Y Parameter 纵轴参数-FL2 ； Gate 设门 -G1=R110.1.3.3 店中阴性对照管FL1/FL2 点图上的十字=Edit-Copy- 点中试验管FL1/FL2 点图 -Edit-Paste10.1.4 做各实验管FL1/FL2 点图的十字统计：点中试实验管FL1/FL2 点图 -Stat-Quadrant Stat-

31、出现统计结果- 点中统计结果框-Stat-Edit Quadrant Stat- 选择输出结果（如Percent of gated 门内细胞阳性百分率）。10.1.5 选择文字工具（A） ，在报告上添加文字说明，报告实验结果。10.1.6 Save As 保存分析模板（ANA文件）或分析结果，Print打印分析结果。10.2 Analysis数据分析（已有模板ANA文件）打 开 已 保 存 的 分 析 模 板 （ ANA 文 件 ） ， 依 次 改 变 各 图 要 分 析 的 数 据 文 件 （ Edit-Select All-Plots-Change Data File ） ， 在出现的窗口

32、中按文件存储路径找到数据，选中第一关文件-open ；在空白处单击一下鼠标，选中第三个图标按苹果+ 调出第二管文件；第四个图苹果 + 以此类推，调整圈细胞群的门R1 的位置，调整十字门位置，根据统计结果更改报告中结果，打印分析结果。11 .HLA-B27 分析和软件操作11.1 样本的制备：11.1.1 试剂：11.1.1.1 HLA-B27 试齐J盒-包括抗体试剂 A,10X溶血素试剂 B,微球试剂 C11.1.1.2 抗凝全血11.1.1.3 流式细胞实验常规试剂和仪器。11.1.2 制备流程：11.1.2.1 在试管上对应于每一个样本做好识别标志（每个样本一个试管）11.1.2.2 加3

33、0 dL抗体到试管中11.1.2.3 用微量移液器小心滴将50以充分混匀的康宁血加到进样管的底部，确保WBC勺浓度在3.5X 103-9.4 X 103WBC/cL之间，低速混匀 3秒钟，室温避光静置15-20分钟；注意：小心避免血样加到试管壁上，一面血与试剂不能充分接触，静置时避免样本直接光照。11.1.2.4 将10X溶血素用蒸储水稀释成1X,每管中加入 2ml试问的1X溶血素，立即低速混匀，避光试问静置10 分钟，不要超过12 分钟；注意：溶血时间不应太长，以免破坏白细胞。11.1.2.5 随后室温300g 离心 5min11.1.2.6 弃去上清液，留大约 50 dL液体于试管中以免损

34、伤细胞团11.1.2.7 低速混匀，重悬细胞，每管中加入2ml含0.1%叠氮钠的PBS清洗细胞，低速混匀，室温300g 离心 5min11.1.2.8 吸去上清液，留大约 50 dL液体于试管中以免损伤细胞团11.1.2.9 低速混匀，重悬细胞，每管中加入含1%-2%|；聚甲醛的PBS来固定细胞，低速混匀，固定30 分钟11.1.2.10 将已处理好的样本管盖好，避光保存于2- 8以待上机检测。最好在染色后24小时以内分析样本，上样前充分混匀悬液以防细胞聚集。11.2 HLA-B27 自动软件上机检测的具体步骤11.2.1 执行FACSCalibur开机程序，进入 HLA-B27软件。11.2

35、.2 在出现的“ sign in ” 窗口中输入操作者姓名、单位、 领导姓名等相关信息，单击 “ Accept ”，计算机将保存这些信息。11.2.3 进入 “ set up” 窗口，首先在 “ Data Source ” 对话框中选择“ From Cytometer ”， 并输入 “ 15000”。然后在：A）“ File name perfix ”中选择“Patient name ”；B）在“Automatic Saving Options "中选择好"Data File "、"Laboratory Report ”,软件会自动生成一个文件夹，文件的

36、默认路径Facstation G5BD filesHLA-B27DDMMYY 文件夹；C）单击“ Location ”可改变文件保存路径；在出现的新的对话框中指定的文件夹，选好文件夹后，单击对话框底部的“ chose”（此步骤为可选项）。D）在“View Report "中选择"Until 'Next' Button Pressed 最后单击“Accept”。11.2.4 进入“ FACSComp窗口，在这里可以进入FACSCom欹件，做 HLA-B27 beads的调试。如果之前做了就单击“Skip FACSComp”。11.2.5 进入“ Patient

37、s ”窗口，在表格中输入相应的 Patient Name 、 ID、 Case Number。11.2.6 然后单击“ Run ,单击“ Acquire不要调节仪器的设置，仪器会自动调出条件。获取完成后打印 Laboratory Report 。11.2.7 如果要继续检测单击“More Tests ”，如果退出单击“QUIT” -“ Don t save ”。11.2.8 退出软件，按每日关机程序清洗仪器，关机。11.3 或用Cellquest Pro/Cellquest手动软件进行 HLA-B27获取和分析11.3.1 打开获取模板（HLA-B27 ACQ文彳）；或制作新模板：11.3.1

38、.1 选择点图或直方图工具，总共画三个图，两个散点图，一个直方图。11.3.1.2 散点图 FSC/SSC 画出一个新的散点图后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗口选择： Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 横轴参数：FSC； Y Parameter 纵轴参数：SSC；选择 Multicolor gate 属性， Gate 设门：如No Gate ；11.3.1.3 散点图 FSC/CD3PE,画出一个新的散点图后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗口选择：Acquisi

39、tion-Analysis 分析； X Parameter 横轴参数：FSC； Y Parameter 纵轴参数：CD3PE;在图中画门 R1圈上CD3书日性的细胞；11.3.1.4 直方图 HLA-B27 FITC/Counts ，画出一个新的直方图后，在Windows-show Inspector ，Inspector 窗口选择：Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 横轴参数：FITC, 选择门 G1=R1选才I Maker工具，在直方图中画M1,圈定所有细胞，选中这个直方图，对直方图进行统计-His-Stats ,统计框中选择 File Name、Ma

40、ker label 、Gate> Mean和 Median;并且改 Plot 菜单下的 Log dataUnit 属性为 Chanel ， Acquire 菜单下 Acquisition Storage 中的 Resolution 属性为256。11.3.1.5 设计试剂参数，在 Acquire 菜单中选择Paarameter Description ， 在对话框中设定：P1=FSC，P2=SSC， PS=HLA-B27 FITC， P4=CD3 PE。11.3.1.6 图形设置完毕，选择 SAVE AS保存为HLA-B27 ACQ文件模板。Acquisition Control 窗口；

41、11.3.2 联机 Acquire-Connect to cytometer11.3.3 数据获取前的设定：11.3.3.1 Acquire-Accquisition Storage- 设定获取细胞数（10000-ALL ） -OK11.3.3.2 Windows-Browser 对话框选择：-Directory 设定存储数据文件的文件夹；-File 设定数据文件的名字：文件前缀（Prefix ） -自定义；文件后缀（Surfix ） -管号；11.3.4 打开获取条件窗口，调出实验获取条件（Instrument Setting ） ；11.3.4.1 Cytometer-Detectors/

42、Voltage11.3.4.2 Cytometer-Instrument Setting-open下找到并选择Calibur file.B27Threshold 。，在 Facstation G5BD fileInstrument 文件， Open-Set-Down.11.3.5 样本优化实验条件：Acquisition（不能调节各荧光电压和补偿）：Control ? Setup- 上样 -Acquire- 进行实验获取条件的调整-调整FSG SSC电压使细胞完全显示在 FSC/SSC图上;- 调整FSC阈值（Threshold ）：减少碎片;-调整FSC/CD3 PE中的R1,圈定需要分析的

43、细胞（CD3+）;-调整HLA-B27/Counts中的M1,圈定所有细胞。（M1可以画的大一些）- 可以保存经样本优化过的实验条件：Cytometer-Instrument Setting-Save 保存实验获取条件 （ InstrSet B27 ） -Done。11.3.6 顺序上样，获取数据文件：Acquisition Control- Setup- 上样 -Acquire- 仪器获取足够细胞后，自动保存数据文件（data file ） 。11.3.7 调节FSC/CD3 PE中R1的位置准确地圈定好需要分析的细胞；并同时调节HLA-B27/Counts中的M1,把所有细胞出现白峰全部圈

44、住； His-Stats统计表中统计出 B27的平均荧光，得出分析结果。11.3.8 输入相关信息，保存并打印统计结果，退出程序。12 .DNA测定12.3 材料和试剂12.1.1 抗凝外周血；12.1.2 DNA QC Particle , DNA测定质量控制试齐U盒（ BD公司,349523） CEN刃、鸡红细胞核，CTN小牛胸腺细胞核，2dm的荧光微球，核酸染料PI。12.1.3 CycleTEST PLUS DNA ReagentKit试剂A,试剂B,试剂C,缓冲液12.2 样本制备12.2.1 质控样本的制备（DNA QC Particle ）CEN:轻轻摇匀后，吸取 40 dL到1

45、mL PI中，混匀室温避光放置10分钟，即可上机。CTN:大力震荡试剂瓶，吸取 40 dL至ij 1mL PI中，混匀室温避光放置10分钟即可上机检测。12.2.2 外周血 DNA羊本的制备（Cycle TEST PLUS DNA Reagent Kit ）12.2.2.1 将100d L抗凝外周血全 加入17100-mm 的管中12.2.2.2 加入1的溶血素2ml,混匀，室温放置 10分钟12.2.2.3 室温 300 g 离心 5 分钟，吸去上清液12.2.2.4 加入2mlPBS洗涤细胞1次，室温300 g 离心5分钟，吸取上清液12.2.2.5 加入250 d L A液，轻轻混匀，不

46、要震荡，室温静置10分钟12.2.2.6 加入250 d L B液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟12.2.2.7 加入250d L C液，轻轻混匀，不要震荡，低温（28C）避光静置10分钟12.2.2.8 用50 dm尼龙网膜或35 dm细胞过滤器过滤细胞12.2.2.9 低温避光放置以待上机检测。建议在加入C液后3小时内上机，上机前轻轻混匀细胞悬液。12.3 .Acquisition ：用 CellQuest/CellQuest Pro 软件获取数据12.3.1 打开获取模板（ACQt件）或制作新模板：图 1 ：选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，在出现的点图对话框或Inspecto

47、r 中，选择：Acquisition 获取；X Parameter 横轴参数：FSC 丫 Parameter 纵轴参数：SSC OK-出现相应的点 图。图 2 ：选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，在出现的点图对话框或Inspector 中，选择：Acquisition 获取；X Parameter 横轴参数：FL2-W; Y Parameter 纵轴参数：FL2-A; OK-出现相应 的点图。图3：选择直方图，在窗口拖出大小合适的方框，在出现的直方图对话框或Inspector 中，选择：Acquisition 获取；X Parameter横轴参数：FL2-A ; OK-出现相应的直方图。在本

48、图横轴 200和400 的位置分别设 M门，标为 M1和M2;对此图进行统计（Stats-Histogram Stats ）,对M1和M2进行 统计 :File name,Marker,%Gate,Mean,CV 。三个图形都设置完毕，File中选择SAVE AS,保存模板ACQ文件。12.3.2 联机 Acquire-Connect to cytometer ，出现 Acquisition Control 窗口，出现AcquisitionControl 和 Browser 窗口，先将Browser 窗口最小化；12.3.3 数据获取前的设定：Acquire-Accquisition Storage- 设定获取细胞数（20000） -OK；Acquire-Parameter Discription 对话框（Browser 窗口最大化）选择：-Directory :单击Change设定存储数据文件的文件夹；-File ： 设定数据文件的名字：文件前缀 （ Prefix ） - 自定义； 文件后缀（ Surfix ） - 管号 （设为 1 ） ，单击OK；